JMC | 深度分析挑戰類藥五規則的那些藥物靶點

輝瑞公司資深藥物化學家Lipinski在2001年提出的篩選類藥分子的五條基本法則，簡稱，Rule of 5(Ro5), 簡稱五規則因為都和數字5有關。Lipinski五規則的內容是：分子量小于500，氫鍵給體 (包括羥基、氨基等)的數量不超過5個，氫鍵受體的數量不超過10個，化合物的油水分配系數的對數值 (logP) 不超過5。符合五規則的化合物會有更好的藥代動力學性質，在生物體內代謝過程中會有更高的生物利用度，因而也更有可能成為口服藥物。在藥物研發領域，Lipinski五規則被廣泛用于對化合物庫的初篩，以期摒除那些不適合成為藥物的分子，縮小篩選的范圍并降低藥物研發成本。

此規則的目的是使化合物的設計過程更加合理，以免產生非極性，結構松散且過大的分子，從而提高口服生物利用度和其他所需的藥物ADME特性。盡管Ro5一直是指導開發口服藥物的有用方針，但當今醫學實踐中使用的許多療法都是通過胃腸外給藥，而且艾伯維公司的科學家從超越五規則（bRo5）的藥物研發項目中總結出的觀察結果顯示許多違反Ro5的化合物都是很好的候選藥物，例如一些天然產物屬于bRo5但也有很好的生物利用度，FDA批準的激酶抑制劑中三成是bRo5以及阻斷PPI的小分子中50%是bRo5，這直接推動了越來越多的人開始在Ro5以外的化學空間進行藥物開發。烏普薩拉大學的Doak等人選擇了48種bRo5化合物及其靶標，深入研究了每個特定配體-受體間的相互作用，本文描述了對其中的37個bRo5靶標及其可用配體的實質性擴展分析。

對37種靶蛋白的分析集中在蛋白-配體結構的結合熱點上。熱點（hot spot）是蛋白質表面上對配體結合自由能貢獻不成比例的小區域，因此配體通常與一個或多個熱點重疊。作者使用蛋白質作圖程序FTmap(http://ftmap.bu.edu/)來確定結合熱點。FTmap在要研究的蛋白質表面上分布大小，形狀和極性不同的有機探針小分子，找到每種探針類型最有利的位置，對探針進行聚類并根據其平均能量對聚類進行排名。結合幾個不同探針簇的區域稱為共有位點，即為預測的結合熱點。預測的熱點與通過實驗方法確定的熱點一致。此外，熱點的強度（探針簇的數量）表明在結合小分子的情況下，熱點相對能量的重要性。

根據每種蛋白質上包含的探針簇的熱量對熱點進行排名，最強的熱點從0開始編號，每個熱點中探針簇的數量顯示在熱點排名后的括號中。根據熱點集合的不同結構，將37個靶標分為“復雜”和“簡單”兩類，復雜的熱點結構含有四個或更多熱點的結合位點，平均探針簇為68.88，簡單的熱點結構具有三個或更少的熱點，平均探針簇為29.88。Wilcoxon-Mann-Whitney檢驗均顯示有顯著差異。

圖1. 由FTmap確定的復雜與簡單的結合位點熱點結構示例

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Doak等人對于每個靶標僅描述了一種特定的臨床藥物。為了研究蛋白質如何與不同的配體結合，作者分析了所有在PDB庫中與所研究靶標有至少90%序列同一性的蛋白-配體復合物結構，且庫中記錄了結合親和力的信息。擴展的數據集包括具有結構數據的1499個配體-蛋白質復合物。將所有MV>500的配體標記為“延伸Ro5”（eRo5）或bRo5，前者為500<MW<700Da和ClogP<7.5其他滿足五規則的化合物，后者為分子量大于700或違反了任何Ro5標準及eRo5限制的配體。用這個標準將靶標集分為23個具有eRo5配體的靶標和14個具有bRo5配體的靶標。利用該拓展配體數據集探索MV>500Da的藥物為什么在臨床試驗中通常比較小的候選化合物更成功的原因。所有配體的親和力（KD,KI,IC50）被轉換為pBA，其值大于7被認為配體具有高親和力。

作者主要依據結合親和力與MW之間的相關性將24個具有復雜熱點結構的靶標進一步分為COMPLEX I和COMPLEX II，前者的結合親和力與配體分子量之間呈正相關，而后者則不存在這種相關性。此外，24個靶標中有8個因其有結合數據的配體-蛋白質結構太少而被歸為COMPLEX III，這一組靶標將被用于討論開發eRo5/bRo5藥物的可能性。

圖2.與eRo5/bRo5結合的COMPLEX I，II，簡單結構靶標及其配體的特征示例

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該組有9個靶標，分別為Thrombin，Renin，E3 ubiquitin-protein ligase，p38 MAPK，HIV-1 Aspartic Protease，Hsp90，MEK1，BRD4和PPARγ。凝血酶的bRo5配體Argatroban相對于滿足Ro5的配體GR157368而言，結合更多的熱點且具有更高的親和力。根據FTmap，凝血酶在抑制劑結合位點具有5個結合熱點，共有57個探針簇，其配體表現出pBA與MW之間的正相關關系。眾所周知，低分子量的凝血酶抑制劑存在選擇性差，固有毒性，代謝不穩定和口服生物利用度差等缺點，bRo5配體則由優異的藥物特性，經分析，可能是因為bRo5通過占據所有熱點而獲得大量結合能，從而能折中化合物某些位置上的結合互補性。雖然會帶來藥學上的不足，但會使配體具有更好的功能結構同時具有足夠的整體結合親和力。另外，bRo5更復雜的結構可能會減少脫靶結合的機會。腎素是另一種典型的Complex I蛋白。FTmap分析指出，62個配體也顯示出pBA和MW之間的正相關性。腎素在抑制劑結合位點有6個熱點，共74個探針簇。bRo5抑制劑aliskiren是美國FDA批準的唯一可用的腎素直接抑制劑，雖沒有最高的親和力，該抑制劑卻因為延伸到了一個狹窄的深處，占據了熱點1（15）而具有比擬肽更好的生物利用度。猜測仍然是因為其占據了全部熱點而獲得的額外結合能改善了藥物特性。

圖3.經FTmap確定的結合了示例配體的復雜I型靶標的熱點結構，藍色配體代表eRo5/bRo5藥物，粉色代表較小的化合物

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E3泛素蛋白連接酶XIAP的bRo5化合物birinapant是一種二價SMAC模擬化合物，目前正在臨床試驗中用于治療癌癥。FTmap鑒定出的20種XIAP抑制劑均表現出pBA與MW之間的正相關關系，但小化合物（MW<500Da）和eRo5/bRo5均可實現高親和力?？赡懿恍枰Y合XIAP中的所有熱點來抑制靶標活性。

P38促分裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）有四個熱點，配體的pBA和MW也顯示出強正相關性。該靶標抑制劑屬于III型激酶抑制劑，可與鄰近的ATP結合口袋的變構位點結合，這與I和II型抑制劑與靶標的結合方式非常不同。bRo5配體PF-03715455結合全部4個熱點達到最高的親和力，小分子量抑制劑P7B僅結合DFG-out構象中的熱點即可達到相當高的親和力。盡管p38 MAPK仍是具有挑戰性的藥物靶標，但結合所有熱點（包括疏水性變構結合口袋中的熱點）的eRo5/bRo5配體實現了最高的親和力，且可能還有更高的選擇性。

該組有7個靶標，分別為Tyrosine Protein Kinase ABL1，EGFR，ALK，Glucocorticoid Receptor，VEGFR- 2，polo-like kinase 1和HGFR。這些靶標的配體的pBA和MW之間不存在相關性，且通常配體在低分子量（MW<400Da）條件在即可實現高親和力結合。小分子激酶抑制劑通常結合在DFG-in中的ATP結合位點結合，為較大的抑制劑通常到達僅在DFG-out構像中存在的“后袋”。6個靶標為激酶。對于這些靶標的eRo5/bRo5配體而言，它們的存在并不是為了提高活性，而是為了提高選擇性。以ABL1為例進行說明。ABL1抑制劑作為一線藥物被用于治療大多數慢性粒細胞白血病。FTmap顯示其DFG-out構象有4個熱點，2個位于ATP結合位點附近，兩個位于后袋。DFG-in構象有5個熱點，均位于ATP結合位點附近。小配體PPY-A可以高親和力地結合DFG-in構象，而較大的藥物nilotinib通過延伸進入DFG-out口袋來利用該構象中的所有4個熱點，但是與較小的抑制劑相比，它只能實現略高的結合親和力。另外的bRo5配體dasatinib，bosutinib和ponatinib也與DFG-out構象中的所有4個熱點結合，但較小的抑制劑與它們都有可比的親和力。這可能是由于熱點從DFG-in構象的ATP位置向DFG-out構象的后袋整體轉移的原因。為ABL1設計更大的化合物的動機是提高選擇性而不是親和力。

圖4.經FTmap確定的激酶DFG-in與DDG-out構象熱點結構，粉色代表DFG-in,藍色配體代表DFG-out

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該組有8個靶標，分別為Cyclophilin A，DOT1-like Histone H3 Methyltransferase，Lanosterol 14α-Demethylase，Bcl-2，Isoleucyl-tRNA Synthetase，FKBP12，TLR4和FGFR1。由于該組共結晶結構數量少于9個因此無法構建配體結合圖譜，沒有試圖尋找這些靶標從bRo5配體中獲益的原因。

該組有13個靶標，由于這些靶標在配體結合位點的熱點少于三個，這將靶點置于可藥的閾值。這些弱結合位點通常位于深腔或狹窄峽谷中，或者與其他熱點隔離開來。FTmap分析顯示一些具有簡單熱點結構的靶標，其配體在pBA和MW之間顯示正相關，而另一些則沒有。

驅動蛋白Eg5有3個結合熱點，它們在相當深的口袋中緊緊相鄰。28個配體中，每個配體都與結合位點的3個熱點結合，分子量在274到517Da之間，且pBA和MW之間存在正相關關系。臨床候選藥物ispinesib是bRo5配體，與熱點的重疊相比其他配體更強，更深地進入結合口袋，并與腔壁作用從而產生更高的結合親和力。

HMG-CoA還原酶也有三個熱點，19個配體的分子量從408到655Da不等，與驅動蛋白EG5配體不同的是，HMG-CoA還原酶配體的pBA和MW之間沒有任何相關性。bRo5化合物阿托伐他汀與腔壁作用并具有可接受的結合親和力（MW:558.64Da,pBA=8.21）,而已知最小的他汀類藥物美伐他汀也占據三個熱點且具有足夠的結合親和力（MW:408.53Da,pBA=7.64）。

圖5.經FTmap確定的結合了示例配體的簡單型靶標的熱點結構，藍色配體代表eRo5/bRo5藥物，粉色代表較小的化合物

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這項研究的目的是了解為什么某些靶標會從違反傳統Ro5標準的藥物中受益，借助Doak等人研究的具有eRo5/bRo5配體的37種靶標，為其創建了更大的配體庫。使用FTmap對靶標的結合熱點進行分析發現可將這些靶標分為“復雜”和“簡單”兩類。在結合譜的支持下，作者發現具有復雜熱點結構的靶標，能夠通過eRo5/bRo5配體獲得更好的親和力并改善藥物特性比如選擇性及毒性。具有簡單熱點結構的靶標，提高結合力是其利用eRo5/bRo5配體的常見動機。這些數據鼓勵在針對化學易加工的靶標設計配體時考慮使用bRo5配體，該方法也適用于低可藥性靶標。

參考文獻

Egbert, M.; Whitty, A.; Keseru, G. M.; Vajda, S., Why Some Targets Benefit from beyond Rule of Five Drugs. Journal of medicinal chemistry 2019.