JMC | 分子對接指導半胱氨酸蛋白酶抑制劑的理性藥物設計

長期以來，天然產物在藥物發現中發揮著重要的作用，約70%的臨床有效藥物是受天然產物或其衍生物啟發而得到的。近年來，海洋天然產物也成為了新藥的來源之一，目前從海洋生物中提取出來用于臨床的藥物已達到13種且有31種處于臨床開發階段。半胱氨酸蛋白酶是治療神經系統疾病和寄生蟲病極好的潛在靶標，首次從巴拿馬海洋藍細菌中分離出來的化合物Gallinamide A被證實具有抗惡性瘧原蟲的活性，此后又陸續發現該化合物能與組織蛋白酶L不可逆結合，是人組織蛋白酶L的一種既有效且具有高度選擇性的抑制劑。人組織蛋白酶L參與產生具有突觸功能的肽神經遞質的過程，在神經退行性疾病中起重要作用。經序列比對，它與從導致熱帶病的寄生蟲中發現的許多蛋白酶具有高度的序列一致性和結構相似性，比如克魯茲錐蟲半胱氨酸蛋白酶（Trypanosoma cruzi），這種蛋白酶是恰加斯病的病原體，針對這種病的治療方法可能會產生嚴重不良反應和感染。因此迫切需要開發針對造成慢性感染的無鞭毛體階段的新療法，針對人組織蛋白酶L的抑制劑能為抗南美錐蟲病藥的發展提供有用骨架分子。

將人組織蛋白酶L和腈抑制劑共價結合的共晶結構導入MOE中，除去腈配體并修復蛋白結構，將Protonate 3D模塊的PH值設為5.5（質子化蛋白酶L能達到的最大活性），力場選擇Amber14:EHT。將Gallinamide A導入MOE，按同樣的標準進行質子化和能量最小化。對接方案選擇induced fit（誘導契合）將分子對接到處理后的組織蛋白酶L上，允許受體配體具有一定程度的柔性。計算烯酰胺的反應性碳與半胱氨酸硫醇中硫原子的距離，據此再過濾掉不合適的結合模式，并采用GBVI/WSA dG的結合自由能打分方法獲得小分子的最優結合構象，最優構象對接得分為-10.70，與之前報導的姿勢比較發現酰胺核心官能團的羰基在活性位點裂口的氧陰離子孔中通過形成氫鍵得到了良好的支撐，這是穩定中間抑制物質的重要特征。以此結合姿勢作為起始結合姿勢，對化合物1的結構進行了結構修飾得到16個化合物，能量最小化后重新進行分子對接，評定預測的結合親和力和反應性碳和硫原子之間的距離變化?；谂c常見組織蛋白酶底物的比較以及MOE對結合親和力的預測，改變天然產物1中R’和R’’對應的L-Ala為L-Phe均能適度改善對接分數。越負的對接分數預計具有越高的結合親和力。

圖1.?組織蛋白酶L和Gallinamide A的結合模式(A)和相互作用圖(B), 對化合物1進行的結構修飾和對接打分(C)

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逆合成分析將分子分為3個部分：酰胺核，環化的頭部和由脂肪族氨基酸組成的親脂性尾巴。第一步由Boc-L-丙氨酸-OH形成酰胺核，首次反應形成Weinreb酰胺。頭部的合成路線很大程度上取自Stolze的路線，該路線使用基于EDC的偶聯反應附加丙氨酸并形成烯酰胺核心，隨后將其脫保護，用Meldrum酸擴展并環化。通過Mitsunobu反應捕獲所得的烯醇以完成頭部基團。在形成尾部并將其耦合到酰胺核的最后步驟中，該路線也很大程度上遵循了Stolze的步驟，但進行了一定程度的修改。

圖2.?Gallinamide A的全合成路線

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不可逆抑制劑的IC50在抑制劑和酶濃度增加的情況下會呈現出隨時間變化的趨勢，這使得終點劑量反應實驗不適用于評估抑制劑的效力。因此，作者采用動力學方法確定抑制的速率和效力。將抑制劑和酶與10μM的熒光底物cbz-FR-AMC混合，并在90分鐘內監測產物的形成，產生的進度曲線的抑制劑濃度在0.0169-1000nM之間，將曲線基于兩步不可逆反應擬合至非線性最小二乘回歸曲線。計算出的Gallinamide A的Ki為4.67±0.40 nM，與先前報導的5.0nM一致。kinact/Ki = 901 000表明化合物1是一種非常有效的抑制劑。大多數化合物的kinact 非常相似，表明這些Gallinamide A衍生物中抑制劑的驅動力是可逆EI配合物的形成速率而不是共價鍵形成速率造成的。且將烯酰胺中的雙鍵還原之后得到的化合物17，稀釋實驗顯示17在1h后的動力學讀數中表現出使酶活性恢復的跡象，證實了烯酰胺核心是天然產物的藥效團。

圖3.化合物17的稀釋實驗及Gallinamide A(A)衍生物的動力學數據(B)

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基于組織蛋白酶L和克魯茲錐蟲蛋白酶之間結構和功能的相似性，用無鞭毛階段的錐蟲去測試Gallinamide A及其衍生物的生物活性。將錐蟲感染的宿主細胞孵育3天之后添加待測試化合物，分析發現Gallinamide A顯示出顯著活性，LD50= 14.7 nM±2.3，并證實其對重組Cruzain的IC50達到0.26nM±0.02?；衔?是最有效的衍生物，LD50?僅為5.1±1.4 nM，對濃度高達10μM的宿主細胞無毒性。Cruzain對寄生蟲的生存至關重要，因此，化合物對其的抑制將會迅速導致克魯茲錐式原蟲的細胞死亡。

圖4. Gallinamide A(1)可以有效地從小鼠宿主細胞中消除克氏錐蟲

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本文利用分子對接和建模以及全合成的方法，確定了天然產物Gallinamide A中的幾個結構特征，并對這些結構特征進行修飾得到16個衍生物來改善與人組織蛋白酶L的不可逆結合。動力學分析和烯烴飽和實驗進一步確定了Gallinamide A發揮抑制作用主要是烯酰胺核心基團參與的不可逆步驟造成的?；谌私M織蛋白酶L和克氏錐蟲蛋白酶的結構功能相似性，抗南美錐蟲病的活性研究證明Gallinamide A及衍生物5具有nM級別抗克氏錐原蟲的活性，為抗南美錐蟲病和可能的抗白熱病藥物的發展提供了有用的分子骨架。

參考文獻

Boudreau PD, Miller BW, McCall LI, et al. Design of Gallinamide A Analogs as Potent Inhibitors of the Cysteine Proteases Human Cathepsin L and Trypanosoma cruzi Cruzain. J Med Chem 2019.