背景
人類免疫缺陷病毒（HIV-1）逆轉錄酶（RT）是一種多功能蛋白，包含DNA聚合酶活性和核糖核酸酶H（RNH）活性。RT包含66 kDa亞基（p66）和p66衍生的51 kDa亞基（p51），聚合酶和RNH活性位點均位于p66亞基中。目前雖然有超過10種臨床批準的聚合酶抑制劑可供使用，但是這其中確沒有RNH抑制劑。鑒于RNH活性對于病毒復制至關重要，因此RNH抑制劑有可能成為抗病毒的重要手段。為了能夠合成并測試的幾種不同類型的RNH抑制劑，前輩們已經做出了很大的努力，包括通過二價金屬離子與RNH活性部位結合的抑制劑。但是，迄今為止，尚且沒有任何RNH抑制劑具有實質性的抗病毒活性，并應用于臨床。原因在于我們對于RNH抑制劑相互作用的結構信息了解很少，直到最近才公開了與RT或分離的RNH活性部位抑制劑的晶體結構。在所有這些晶體結構中，抑制劑以相似的方式與兩個金屬離子配位，但是抑制劑與蛋白質之間的疏水或氫鍵相互作用在在不同結構之間有所不同。蛋白質結構對抑制劑效能的影響尚沒有明確的結果。最近，XI等人發表了與羥基異喹啉二酮（HID）型活性位點抑制劑YLC2-155配合使用的RT晶體結構，表明該抑制劑以兩種結合方式與RNH結合位點相互作用。對于晶體結構和分子對接的研究結果表明，該抑制劑通過其羥基和羰基螯合了兩個Mn2 +離子，而其余化學基團則以兩種不同的構型在RNH周圍存在，一種朝向Q500，另一種朝向H539。使用分離的RNH結合位點進行的NMR實驗顯示，當在Mg2 +存在下與YLC2-155結合時，一些RNH殘基會產生兩組共振。但是，尚未研究分子相互作用的詳細機理。除了RNH活性位點抑制劑的螯合特性外，抑制劑與RNH中保守殘基的特異性相互作用在抑制活性中也起著重要作用。所以研究RNH抑制劑的重點是要研究這些因素的影響以確定抑制劑相互作用的機制。
在復合物（5UV5）的晶體結構中觀察到的YLC2-155與RNH結合位點的兩種結合模式的視圖。使用了Mn2 +用于確定晶體結構
圖片來自ACS
本文中，XI等人使用NMR光譜，差示掃描熒光法（DSF），分子對接和量子化學計算方法，對包含Mg2 +的RNH結合位點及抑制劑的三元復合物進行了全面的相互作用研究。對于NMR和DSF研究，使用了分離的RNH區域（427至560殘基），即通常用于研究活性位點抑制劑與金屬的相互作用的部分。Mg2 +可能是HIV-1 RNH活性不可或缺的輔助因子。但是，在生理條件下，由于結合力弱，預計RT中的RNH不會完全被Mg2 +飽和。因此，重要的是要了解抑制劑的結合方式以及是否使無Mg2 +結合態與有Mg2 +結合態之間的平衡向著Mg2 +結合態轉移并最終向RNH-Mg2 +-抑制劑三元絡合物轉移。為了解決這個問題，他們將Mg2 +的濃度從1改變為20 mM，以生成無Mg2 +和結合Mg2 +的RNH的不同群體。他們還改變了20 mM Mg2 +的抑制劑的濃度，以生成三元絡合物的不同群體，并通過NMR監測狀態變化。NMR實驗是在兩種不同的條件下進行的?；贖ID的活性部位RNH抑制劑YLC2-155和羥基嘧啶二酮（HPD）型活性部位抑制劑ZW566。對以上兩種抑制劑進行分子對接和量子力學計算，以研究結合模式，蛋白抑制劑相互作用和螯合特性。兩種抑制劑都在兩個方向上結合RNH，但是，與YLC2-155相比，ZW566表現出更多的蛋白質相互作用和更強的金屬螯合能力?？傮w而言，XI等人的發現為RNH藥物設計提供了寶貴的經驗。
結果
（A）中顯示了本研究中使用的RNH活性部位抑制劑的結構。（B）YLC2-155或（C）ZW566結合時顯示分裂共振的殘基被映射到RNH域（PDB 5UV5）的晶體結構上，并被涂成紅色。金屬離子顯示為球形，金屬結合殘留物顯示為棒狀
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通過構象搜索預測ZW566分子有52個不同共構象。使用靈活的配體采樣方案，將所有不同構型的配體對接到RNH的活性中心，對于每個構象，均以特定方式對接。對接后進行分析來獲得每個構型的平均結構，并計算RMSD來評估對接方式與平均結構的關系，XI等人得出結論，ZW566出現兩種獨特的結合模式。結合模式1，從44個對接方式中獲得（在對接的44個構象中最低的能量為?8.09 kcal/mol），而從8個不同對接方式中獲得的結合模式2（最佳對接能量為?7.36 kcal / mol）,在兩種結合模式下，ZW566相對于幾個活性位點殘基的位置是不同的，包括表現出分裂NMR信號的那些殘基和位于分裂信號殘基附近的那些殘基；在結合模式1中，ZW566更接近于Ala445，Ala446和Val552，而結合模式2則使ZW566靠近Val536。此外還在與ZW566相同的對接條件下進行了YLC2-155與RT的分子對接，以直接比較兩種抑制劑的結果。為了保證YLC2-155對接方式與先前發布的對接方式相同，顯示了兩種結合模式。ZW566結合方式1和2與YLC2-155的兩種結合方式不同。在兩種YLC2-155結合模式下，螯合三聯體都位于同一平面上，并且以相似的角度接近金屬陽離子。ZW566結合模式2與YLC2-155結合相似，螯合三聯體與YLC2-155重疊。如配體相互作用圖（LID）所示，在兩種結合模式下，與YLC2-155相比，ZW566被大量殘基包圍。相反，YLC2-155與RNH的相互作用主要在螯合金屬離子的羥基異喹啉二酮核心處或附近。為了了解ZW566與這些周圍氨基酸殘基相互作用的重要程度，?當兩種結合模式以相同角度螯合金屬陽離子時，我們將ZW566結合模式1與結合模式2的螯合三聯體疊加，模擬“ YLC2-155樣”結合。此ZW566疊加的LID顯示，以類似于YLC2-155的方式結合ZW566會導致氨基酸接觸少得多，并且完全將氟化環和氨乙基暴露在溶劑中。
分子對接顯示兩種結合YLC2-155和ZW566的模式
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分子對接計算表明與Mg2 和RNH結合的ZW566相互作用更強；XI等人計算了影響對接得分的相互作用能。我們發現，與YLC2-155相比，ZW566的金屬結合，疏水相互作用和范德華相互作用均明顯更強，這與觀察到的對ZW566的親和力比YLC2-155高一致。與ZW566相比，范德華力較小， 庫侖能量相近。
?計算的ZW566和YLC2-155最穩定構型的對接分數和其主要成分（以kcal / mol為單位）
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?ZW566的兩種不同于YLC2-155的結合模式
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量子力學計算表明ZW566上的負電荷比YLC2-155??；與RNH區域結合的Mg2 +具有大于1 mM的解離常數，在存在Mg2 +的情況下ZW566和YLC2-155與RNH結合的解離常數分別為1.9±1.7和17.9±7.3μM。這些觀察表明，金屬-抑制劑的相互作用可以穩定三元絡合物。在對接研究中，XI等人研究了每種抑制劑與RNH的Mg2 +結合形式的相互作用。但是，金屬-配體相互作用能不能通過對接算法正確估算，對金屬-配體配位的準確描述涉及對配體原子上電子密度分布的考慮以及將電子從原子中移出所需的能量。該信息只能從量子力學計算中獲得，而量子力學計算則不包括在對接算法中。因此，為了更好地了解ZW566和YLC2-155的金屬配位，進行了高精度的量子力學計算，以估算某些電子結構特性，包括部分原子電荷，分子軌道能量和組成以及平均局部電離能。XI等人使用三種不同的方法來計算化合物的原子電荷，以獲得與計算方法相對獨立的電荷分布模式。從靜電的角度來看，當更多負電荷位于配體原子數坐標的金屬，金屬間的相互作用和配體將更強。結果表明與YLC2-155螯合三元組上的電荷相比這三種原子上的總體負電荷更大，ZW566的螯合氧原子更強，這表明ZW566的金屬相互作用比YLC2-155強。他們還對這兩種化合物進行了分子軌道分析，以研究電子從配體軌道到金屬軌道的離域容易程度。盡管未觀察到ZW566和YLC2-155的孤氧對軌道的軌道能量有明顯差異，但ZW566的平均計算局部電離能（ALIE）66.86 kcal / mol，比YLC2-155（ALIE = 70.09 kcal / mol）低約3.2 kcal / mol，這表明電子與YLC2-155相比更易于從ZW566脫離。綜上所述，所有來自量子力學計算的結果表明ZW566與YLC2-155相比，與金屬陽離子的鍵合性更強。此類觀察可能與所觀察到的ZW566結合的Mg2 +敏感性高于YLC2-155結合的Mg2 +敏感性一致。
在理論水平B3LYP / 6-311G **下，通過不同電荷估算方法計算的YLC2-155和ZW566原子的部分電荷
總結
逆轉錄酶RNH對于病毒復制至關重要，迄今為止，還沒有有效的RNH抑制劑來抵抗病毒復制。通過分子對接和量子力學計算，本文研究了影響抑制劑相互作用的因素。實驗數據表明，ZW566與YLC2-155的RNH結合力更強，這可能是ZW566的較高的金屬螯合能力以及與ZW566的更大數量的相互作用造成的。與YLC2-155比較，兩種抑制劑都以兩種不同的結合方式結合RNH，一種構象比另一種更為有利。另外，當與YLC2-155的類似結合模式相比時，ZW566的兩種結合模式之一顯示出與周圍殘基的更多數量的相互作用。因此提高金屬螯合強度，更優的蛋白質抑制劑結合模式可能是開發更有效的RNH活性位點抑制劑的重要方向。因此，開發有效的競爭性活性位點RNH抑制劑的策略不僅應考慮金屬-抑制劑的配位，還應考慮蛋白質-抑制劑的相互作用和構象選擇性。該文章可能為新一代抑制劑的研發提供幫助。
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