引言
Varkud衛星核酶(VS)是已知的最大自裂核酶,也是最大的內切核酶。它存在于自然分離的Neurospora線粒體中,能將多聚體與核糖核酸特異性地切割成線性單體。自從近三十年前被發現以來,VS核酶一直是眾多實驗研究的主題。作者采用實驗與計算相結合的方法,建立了VS催化動力學模型,擴展和統一了已有的實驗數據,明確了催化構型,揭示了過渡態穩定的模式。這些發現拓寬了我們對RNA催化策略多樣性的機制理解。

先睹為快
單位與作者
新澤西州立羅格斯大學Darrin M. York教授,
芝加哥大學Joseph A. Piccirilli教授
研究靶點
VS核酶突變體的高分辨率晶體結構(PDB IDs:4R4P,4R4V,5V3I)
計算方法
分子動力學模擬(Molecular Dynamics (MD) Simulations)
3D-RISM溶劑化模型計算(3D-RISM calculations)
量子力學/分子力學自由能模擬(QM/MM free-energy simulations)
計算軟件
AMBER18,AmberTools 15
計算流程
首先將VS核酶突變體的晶體結構(PDB IDs:4R4P,4R4V,5V3I)修改為相應的野生型核酶。接下來,在AMBER18軟件對三個VS核酸結構進行5000ps的經典MD模擬。通過3D-RISM溶劑化模型計算,預測金屬Mg2+結合位點。最后用量子-經典力學組合方法計算了催化反應的自由能,闡述VS核酶的催化機制。
Varkud衛星核酶
Varkud衛星核酶(VS)是已知的最大的自裂核酶,裂解方式與其他自裂解核酶相似(圖1),通過內部緊靠剪切點的核苷酸上的2’-OH親核取代剪切位點上的磷酸二酯鍵的5’-O,得到兩個反應產物,分別為帶有2’-3’磷酸二酯鍵的RNA和一個游離的5’-OH。已有相關研究報道了對VS核酶的三級結構和活性至關重要的堿基G638和A756,同時金屬Mg2+離子可以穩定VS核酶結構,但Mg2+在活性部位的催化作用尚未確定。在本文中,作者對VS核酶進行了一系列的計算和實驗研究,以表征其功能活性狀態,確定其關鍵的催化過程。?

圖1.?VS核酶催化反應示意圖
圖片來源:Nature Chemistry
計算結果
作者利用目前三種可用的晶體結構作為出發點對WT核酶進行了MD模擬,以確保預測與起始狀態無關,模擬結果如圖2所示。圖2a以相互作用圖的形式描繪了沿著各種MD軌跡中的重要相互作用,根據圖2a,基于不同晶體結構的模擬描繪了核酶特定活性位點相互作用的概率,其中每個催化關鍵元素(α,β,γ,δ)要么不存在,要么不支持有效催化,因此反映不了溶液中的活性狀態。最令人關注的是模擬中缺乏催化活性狀態的形成,即無法滿足“in-line”的催化機制,α和γ催化僅占所有構型的7%(圖2b)??偟膩碚f,在沒有金屬Mg2+的情況下,基于現有核酶晶體結構出發的MD模擬無法反映核酶在溶液中的催化活性狀態。

圖2.?VS核酶的MD模擬結果
圖片來源:Nature Chemistry
目前眾多實驗研究表明Mg2+離子不僅對VS核酶的整體折疊很重要,更直接地參與了活性位點,影響催化過程。對MD軌跡的進一步分析發現,活性位點中有兩個位點被Na+離子高占據(圖2c)。為了確定Mg2+的可能結合位點,作者對不同晶體結構和模擬得到的結構,進行了3D-RISM計算,計算結果預測活性位點A的Mg2+結合概率高(圖2d),并且與先前實驗發現一致。作者通過進一步的金屬離子解救實驗證實Mg2+與核酶活性部位的pro-SP-NPO有特異性配位作用。
基于金屬離子拯救實驗的結果,作者試圖研究Mg2+離子對核酶活性位點動力學的影響。作者重新復制了MD軌跡, 每個結構中Mg2+與A621的pro-SP-NPO結合,并且與上述A622的pro-RP-NPO和G623的N7接近(圖2c-e)。這些模擬的結果總結在圖2f,g中。有趣的是,如相互作用圖(圖2f)所示,這些獨立的軌跡都收斂到與實驗數據一致的活性位點,并展示了所有關鍵的催化過程。在活性位點A結合Mg2+的模擬中,大多數構型(77%)顯示出催化活性狀態(同時顯示α和γ催化),而在沒有Mg2+的模擬中,只有7%的構型顯示出催化活性狀態。在MD模擬中觀察到的活性構型在A位Mg2+存在下增加了11倍,這表明活性位點金屬離子的存在增強了催化作用。進一步的突變實驗也驗證了Mg2+結合模型(圖2e)。
目前對VS核酶催化的一致觀點認為G638和A756分別作為廣義堿和酸發揮作用,盡管有證據支持這些假設,但仍有很多疑惑存在,此外,我們對于從廣義酸到廣義堿的質子轉移程度,及過渡態的性質一無所知。為了闡明VS核酶催化過程,作者測量了一系列帶有腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)類似物的核酶的Br?nsted系數,并得到了A類似物和G的線性關系(圖3a,b)。LFERs結果表明,在過渡態中,廣義堿的質子轉移幾乎完全完成,而廣義酸的質子轉移部分完成。

圖3.?VS核酶的催化機理研究
圖片來源:Nature Chemistry
作者利用QM/MM的方法對催化反應的化學步驟進行了更詳細的研究,獲得了催化反應的自由能面(圖3d)。QM/MM模擬表明G638作為從2’-OH接受一個質子,活化后的2’氧負離子作為親核試劑進攻切割位點的磷酸,其中2’羥基的脫質子活化過程是單獨發生的,P-O2’/P-O5’鍵的形成/裂解和廣義酸的質子轉移以協同方式發生,并且是催化過程的決速步鄹,反應的自由能壘為~10 kcal /mol。模擬得到的過渡態(圖3c)是一個“后”過渡態,其中P–O2′鍵幾乎完全形成,P–O5′鍵大部分斷裂,A756的質子部分轉移到5′O離開基團,這也與LFER數據一致,進一步表明G638的質子轉移可能發生在達到速率控制過渡態之前的預平衡階段。
總結
核酶的催化作用主要由兩部分組成:金屬離子和堿基。從近三十年的研究來看,普遍認為VS核酶催化機制完全依賴于核堿催化。本文中,作者綜合計算和實驗的結果,發現二價金屬離子與磷化氫的pro-SP氧相互作用(圖4),并通過與下游磷酸鹽(A622),G623:N7的pro-RP氧和G638:O6的配位作用來維持VS核酶的活性結構。
作者分析了小型核酶的結構,發現這些核酶有一個活性位點核苷酸,稱為L錨(圖5),可能有助于其定位親核活化。在錘頭狀核酶中,保守的腺嘌呤(A21)充當L-錨,而在發夾狀核酶中,尿嘧啶(U+2)起著這個作用。在目前可用的結構數據中,VS核酶缺乏一個可能起到L錨作用的核堿基,然而,對本研究中定義的VS核酶模型的檢驗表明,新鑒定的Mg2+可能作為L-錨,揭示了VS核酶活性位點結構先前未知的一面。Mg2+在VS中的作用既是作為錨定結構的組織作用,又是靜電作用,在調節總堿基的pKa和通過與切割位點的磷酸相互作用來穩定過渡態。與VS核酶一樣,錘頭狀核酶使用鳥嘌呤作為總堿,需要保守的腺嘌呤和Mg2+進行催化。然而,腺嘌呤和Mg2+在這兩種核酶中的作用是相反的:在VS核酶,A756作為廣義酸起作用, Mg2+充當L-錨;而在錘頭狀核酶中,Mg2+協助酸催化,A9充當L-錨。綜上所述,這些觀察揭示了錘頭、發夾和VS核酶共有的新功能特征。

圖4.?VS核酶過渡態結構的二維示意圖
圖片來源:Nature Chemistry
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圖5.?三種小核苷水解核酶的L-錨結構示意圖
圖片來源:Nature Chemistry
參考文獻
Ganguly, A., Weissman, B.P., Giese, T.J. et al. Confluence of theory and experiment reveals the catalytic mechanism of the Varkud satellite ribozyme. Nat. Chem. 12, 193–201 (2020). DOI: 10.1038/s41557-019-0391-x