引言
手性醇是大量復雜化合物的重要組成部分，在制藥、農業化學、香味和精細化工行業發揮重要作用。利用脫氫/還原酶對前手性酮進行不對稱生物還原是制備手性醇的重要方法。然而工業有廣泛應用的非天然底物，天然酶具有催化活性有限或立體選擇性不足的問題。本文通過分子動力學模擬發現影響催化的關鍵氨基酸，然后進行定向突變重新設計，得到突變酶大大提高了手性醇的轉化率。
先睹為快
單位與作者
福州大學（Juan Lin）與浙江大學（Li-Dan Ye, Hong-Wei Yu）
計算方法與模型
Mu0及其突變體的同源性模型基于NADH依賴的1-(4-羥苯基)-乙醇脫氫酶的晶體（PDB ID: 4URF）, PpYSDR及其突變體用銅綠假單胞菌 PAO1的羰基還原酶（PDB ID: 5WQO）
計算軟件??
分子對接AutoDock 4，分子動力學模擬(Amber 18)
計算亮點
基于限制性分子動力學（MD）模擬中酶與底物復合物構象變化，作者提出了一種基于對MD模擬中有/無底物的酶/底物結合模式分析的策略，即有距離限制（預反應狀態）模擬和無距離限制自由狀態模擬。以對龐大的芳基酮活性較差的短鏈脫氫酶/還原酶（SDR）突變體EbSDR8-G94A/S153L（Mu0）為例，將模擬中構象差異明顯的H145和Y188作為目標，作者重建了底物結合口袋，同時調節了C1和C2口袋相對大小來提高立體選擇性，以此方式設計了用于有效不對稱還原鄰鹵代苯乙酮，丙苯酮，芳族酮酸酯和二芳基酮的突變體，從而將手性醇的轉化率提升到大于 99％，ee提高到大于 98％。通過分子模擬表明，找到合適的結合口袋能改善提高對不同結構的底物的活性和立體選擇性，這是普遍存在的機制。這項研究為合理設計具有寬底物譜和高立體選擇性的醇脫氫酶/還原酶提供了更多的策略。
研究結果
Kazlauskas規則廣泛用于預測和改善酯酶和脂肪酶的立體異構構象結構。因此，在T-state和free-state狀態比較分析和Prelog規則的指導下，對Mu0重新進行了設計，用于不對稱還原各種前手性酮（圖1）。設計原理和策略隨后被用于對PpYSDR的結構修飾，進行驗證。
圖1.?EbSDR8-G94A/S153L (Mu0)的重新設計
?圖片來源 ACS Catalysis
在計算模擬中預反應狀態（Prereaction-State）可用于預測酶對底物的反應性。在脫氫/還原酶的情況下，當催化酪氨酸的羥基氧（OH）與底物（Osub）的羰基氧形成氫鍵，同時NAD(P)H的C4N處的氫原子與底物（Csub）的羰基碳足夠接近能轉移氰化物時，預反應狀態形成。因此，通過計算構象中O sub和OH Y156之間距離[d(Osub-OHY156)]?≤2.8 ?和Csub跟H18NADH之間距離[d(Csub -H18NADH)] ≤3.0 ?的占有率來確定預反應狀態形成的可能性。
為了計算形成預反應狀態的概率，作者將Mu0和難還原酮組裝成Mu0-2aProR用于分子對接，隨后分別進行了兩個狀態的分子模擬（T-state和free-state）。選擇最低能量的結構代表每個模擬中的結合模式。模擬結果表明兩種模擬之間結合方式的明顯差異，暗示難以形成預反應狀態。一方面d(Osub-OH1Y156) 和d(Csub-H18NADH) 在F-state模擬中分別達到 4.24和4.68 ?, 另一方面，同時滿足d(Osub-OH1Y156) ≤ 2.8 ?和d(Csub-H18NADH) ≤ 3.0 ? 的催化構象比例為0（圖2A），顯示出難以完成質子和氫化物轉移的過程。
作者發現發現殘基H145和Y188通過彼此靠近，形成氫鍵的可能性很高（d(OHY188-NE2H145) ≤ 3.2 ? 的比率達到25%)?，T-state和free-state狀態模擬后的結合模式明顯不同(圖2B)，free-state狀態的模擬中發現不適當的能量分布（圖3 E），形成了稱為Mu0-6aProR的R手性醇，因此，H145和Y188被確定為改造的目標殘基。作者隨后將H145和Y188替換為較小的殘基（分別為丙氨酸，甘氨酸和半胱氨酸），幾乎所有測試的底物的轉化率均得到了不同程度的提高（圖3）。
圖2.?Free-state狀態時，底物結合袋中殘基的構象分布圖和能量分解
圖片來源 ACS Catalysis
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圖3.?突變酶的轉化效率
圖片來源 ACS Catalysis
參考文獻
Rational Design of Dehydrogenase/Reductases Based on Comparative Structural Analysis of Prereaction-State and Free-State Simulations for Efficient Asymmetric Reduction of Bulky Aryl Ketones Bing-Mei Su, Ze-Hui Shao, Ai-Peng Li, Muhammad Naeem, Juan Lin, Li-Dan Ye, and Hong-Wei Yu. ACS Catal. 2020, 10, 864?876. DOI: 10.1021/acscatal.9b04778