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    JACS | 量子化學計算揭示D-A環加成酶PyrI4的催化機制

    JACS | 量子化學計算揭示D-A環加成酶PyrI4的催化機制

    先睹為快

    作者? ?

    中國科學院上海有機化學研究所劉文教授

    美國加州大學洛杉磯分校的K. N. Houk教授

    研究對象?

    D-A環加成酶:PyrI4

    計算方法

    量子力學計算(Quantum Mechanical Calculations)

    分子對接(Docking Calculations)

    分子動力學模擬(Molecular Dynamics Simulations)

    結合能計算(MM/GBSA Calculations)

    量子-分子力學組合計算(QM/MM MD calculations)

    計算軟件

    XTB程序,Gaussian 09,Autodock Vina,Amber 16

    計算流程

    作者首先通過DFT計算了非酶參與的不同底物質子化狀態D-A反應,發現了PyrI4的酸催化效應,并通過前線軌道理論揭示其本質是降低了反應的能級差;接著,作者通過docking,MD模擬,QM/MM模擬研究了PyrI4與不同的底物狀態結合,發現了關鍵的Q115?H117?Y85氫鍵三聯體;此外,作者通過反應內稟性計算和MD模擬探究PyrI4的立體選擇性問題;最后作者對PyrI4蛋白N端的α-螺旋結構也進行了研究,揭示了這獨特的“蓋狀”結構對D-A反應過渡態的穩定作用。

    引言

    狄爾斯-阿爾德反應(D-A reaction,簡稱“D-A反應”)是一類能夠直接形成C-C鍵的重要有機反應,可以高效地實現對雜環、手性螺環和橋環等復雜結構的構建,也被廣泛應用在天然產物和藥物分子的合成中。吡咯吲哚霉素(pyrroindomycin,PYR)的生物合成途徑中涉及兩個D-A環加成酶PyrE3和PyrI4(圖1)。這兩個酶的晶體結構也已被報道,其中,PyrI4蛋白獨特的“蓋狀”特征。本文作者通過一系列計算的手段研究了PyrI4催化分子內D-A反應的活化效應和立體選擇性機理。研究發現,PyrI4的關鍵活化效應主要來自酸催化、構象誘導自適應機制,即由底物誘導PyrI4的N端“蓋狀”結構以穩定D-A反應的過渡態構象,產物的立體選擇性合成來源于PyrI4酶增強了底物內在的D-A立體選擇性。

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    圖1.?Pyrroindomycin生物合成生物途徑中涉及的D-A環加成酶

    圖片來源于:JACS

    研究內容——非酶參與的D-A反應的DFT研究

    PyrI4催化合成吡咯吲哚霉素分子中關鍵的的螺環結構,參與圖1中的化合物4到5的過程。作者首先研究了非酶環境下不同PH值對D-A反應的影響,如圖2所示,在氣相中,4a通過exo過渡態TS1a生成5a的反應能壘高達42.2kcal/mol,將要形成的C-C鍵分別為1.8和 3.0?,這說明該環化反應高度異步(highly asynchronous),表明在過渡態形成的部分電荷可能會被極性環境所穩定。特別是,乙醚溶劑化模型(類似于酶疏水內部介電環境)將能壘降低至41.5 kcal/mol,而更為極性的水溶劑化模型將能壘進一步降低至40.0 kcal/mol。然而,目前能壘仍然太高,無法在室溫下自發反應。

    PyrI4酶的第一個潛在催化作用是對tetramate的質子化。PyrI4-產物的復合物晶體結構顯示,活性空腔中富含酸性氨基酸,并且產物的tetramate結構朝向酸性空腔。作者假設PyrI4酶可以質子化內酰胺,通過酸催化加速D-A反應。作者計算了質子化后的4b通過TS1b形成5b的D-A反應能壘為28.8kcal/mol,與非催化反應相比,這種酸催化的D-A反應可顯著降低反應能壘。

    為了解釋為什么PyrI4酶可以通過改變反應的電子性質,使反應勢壘降低12.7kcal/mol。作者進行了前線軌道計算(圖3),與4a相比,4b的HOMO?LUMO間隙較低,(4.6 vs 7.0 ev),因此非催化的D-A反應是一個逆電子需求的反應,而酸催化的D-A反應是一個順電子需求的反應。

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    圖2.?非酶參與的D-A反應的DFT研究

    圖片來源于:JACS

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    圖3.?不同質子化狀態下二烯烴和親二烯烴的軌道分析

    圖片來源于:JACS

    研究內容——PyrI4酶中關鍵相互作用的計算研究

    PyrI4酶的第二個催化作用是與底物的相對高能反應構象結合。圖4展示了PyrI4酶和產物的共晶結構,底物和口袋非常緊密的契合在一起,并且口袋中極性和非極性殘基分布在產物的對立面,極性tetramate部分被親水性殘基(即E65、Y85、E87、Q115和H117)包圍,而非極性十氫萘環與疏水殘基相互作用。作者猜測蛋白口袋中親水和疏水相互作用的協調作用,導致底物先以一種合理的高能反應構象與蛋白結合,然后誘導小分子形成類似D-A反應過渡態的構象。因此,作者提出了一種激活機制,PyrI4只與處于反應性構象(近似過渡態)底物結合。在沒有酶的情況下,這種強制構象變化需要6.8kcal/mol能量(圖5),為了使這一過程自發進行,PyrI4酶必須使反應構象比馳豫構象穩定至少6.8kcal/mol。

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    圖4.?PyrI4酶和產物的共晶結構及相互作用示意圖

    圖片來源于:JACS

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    圖5.?底物構象變化的研究

    圖片來源于:JACS

    分子對接研究表明,4b的反應構象的對接模式與共晶體結構中的產物相似,但4b的馳豫構象不能結合到口袋(圖6)。為了進一步研究不同底物狀態與蛋白的結合力,作者用AMBER16進行了分子動力學(MD)模擬,然后應用MM/GBSA方法估算了4-RC、4-TS和4-P的結合能(?48.4、?49.2、?47.2 kcal/mo),結果表明PyrI4選擇性地穩定過渡態。

    作者發現PyrI4酶的活性中心存在一個氫鍵三聯體,可以穩定TS1b過渡狀態?;谙惹皩雍蚆D研究,如圖7所示,作者構建了一個TS1b?PyrI4復合物理論酶模型(TS1b-T),包含Y85、H117和Q115形成的氫鍵三聯體,由于這三個殘基的存在,TS1b-T過渡態(18.7kcal/mol)的自由能比未催化的TS1b(22.0kcal/mol)低3.3kcal/mol。如果只把Q115殘基劃入,過渡態的能量則為21.1 kcal/mol,相差的2.4 kcal/mol來自Y85?H117?Q115氫鍵三聯體的協同效應。H117與Q115之間的氫鍵增加了Q115的酸性,使其成為更強的氫鍵供體。

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    圖6.?不同底物狀態與蛋白結合的研究

    圖片來源于:JACS

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    圖7.?TS1b?PyrI4復合物理論酶模型

    圖片來源于:JACS

    然而,為了降低D?A反應勢壘,PyrI4酶必須選擇性穩定過渡態,作者假設Y85?H117?Q115氫鍵三聯體,只有在酶促反應進入過渡狀態時才能組裝起來。為了驗證這個假設,作者應用MD模擬了PyrI4分別結合反應物、過渡態和產物時,這一關鍵氫鍵三聯體的動力學行為。結果如圖8所示,只有當與過渡態結合時,氫鍵三聯體才能形成穩定的氫鍵網絡(4b-TS)。通過進一步殘基能量分解表明,其他殘基對反應勢壘的貢獻為0.7 kcal/mol。綜上所述,Q115?H117?Y85氫鍵三聯體將能壘降低3.3 kcal/mol,其他PyrI4殘基共同降低能壘0.7 kcal/mol。最終計算的反應自由能壘約為18 kcal/mol,與實驗kcat換算的16.7 kcal/mol一致。

    綜上所述,PyrI4激活其底物進行D?A反應主要通過:(1)PyrI4質子化底物的tetramate部分,使自由能壘降低12.7 kcal/mol;(2)底物以反應構象與PyrI4結合,使自由能壘降低6.8 kcal/mol;(3)Q115?H117?Y85氫鍵三聯體選擇性穩定過渡狀態,使自由能壘降低了3.3 kcal/mol;(4)其他殘基的貢獻加合將能壘降低了0.7 kcal/mol??偟膩碚f,PyrI4酶一共使D?A反應的能壘降低約24 kcal/mol,使該反應能在室溫下快速發生。

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    圖8.?Y85?H117?Q115氫鍵三聯體的MD模擬

    圖片來源于:JACS

    研究內容——PyrI4酶中立體選擇性問題的計算研究

    隨著PyrI4酶對底物激活作用的確立,作者對PyrI4酶如何控制D?A反應的立體選擇性問題進行了研究。原則上,化合物4的D?A反應可以得到四種可能的產物。作者首先研究了這個反應的固有選擇性(圖9),結果顯示,exo產物過渡態(TS1b)比endo產物過渡態在能量上低,反應會傾向形成TS1b。為了研究PyrI4對D?A反應立體選擇性的影響,作者將四種可能的過渡態分別對接到PyrI4的活性中心。TS1b和TS4b都能與鍵殘基Q115形成氫鍵,但只有過渡態TS1b與產物結構有顯著重疊。雖然四種過渡態的結合能預測值相似,但TS1b顯示出最大的結合自由能(?12.6kcal/mol)。作者分別對四個過渡態的復合物進行了500 ns MD模擬,通過追蹤關鍵的鍵長變化,發現只有TS1b可以保持反應構象,相比之下,其他立體異構體已經馳豫為非反應構象。這些結果表明PyrI4的活性口袋已經演化成選擇性地結合底物構象,從而得到了目標產物5。

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    圖9.?PyrI4對四個立體異構過渡態的選擇性

    圖片來源于:JACS

    研究內容——特殊的α-螺旋結構(α0)的角色研究

    在闡明了PyrI4的活化機理和立體選擇性的基礎上,作者進一步研究了lid在PyrI4的催化機理中的作用。PyrI4中有一個獨特結構特征即催化空腔頂部存在一個短的N-端α-螺旋(α0),稱為lid。先前的實驗突變表明,α0對PyrI4的活性至關重要,核磁共振研究表明其是高度動態的。作者先前假設α0可以捕獲柔性底物,從而促進底物結合。為了研究了底物存在與否對α0的構象變化影響,通過DSSP分析了MD模擬中α0的二級結構變化。作者首先研究了野生型PyrI4(WT)在高溫下的熱穩定性(圖10)。在apo-PyrI4(不包含底物)在373k下的1μs MD模擬中,α0分解成一個無規則的線圈(圖10C)。在373 K溫度下的模擬時間內,α0的螺旋結構占比56%(圖8A),而在室溫下,該占比為82%,這與實驗觀察結果一致,即在反應前將酶在100℃下加熱20分鐘可導致酶活性降低約50%。接下來,作者研究了底物結合后對α0的影響,當PyrI4與天然底物的反應構象結合時,α0的螺旋結構的統計含量較高(92%),并且過渡態結合時達到最大值(94%)。相比之下,apo-PyrI4(WT-apo)的α0在相同的模擬條件下顯示出較少的(82%)螺旋結構。這些結果表明,當α0與反應構象的底物、過渡態結合時,其熱力學穩定性較高。

    為了解釋為什么α0與底物結合時會更穩定,作者著重研究了位于α0起始位置的精氨酸(R9)。單點突變實驗表明,突變株R9A的催化不活躍。對apo-R9A的MD模擬表明,與野生型(82%)相比,R9A的α0具有相似的螺旋含量(79%)。然而,與野生型相比(94%),R9A-TS復合物的α0-螺旋含量較低(78%),表明底物不能像野生型那樣穩定R9A突變體的α0結構,因此,TS與R9A突變體的結合力不如WT,結合自由能計算結果也證明了這點。進一步研究了R9在催化反應中的作用,從各種MD模擬結果分析,作者發現在WT-TS復合物中R9與D74形成鹽橋相互作用(圖11),這種鹽橋作用只有在TS與WT-PyrI4結合時才穩定。在WT-apo模擬中,R9以隨機取向存在,并且大部分時間與水溶劑分子相互作用。相反,當底物與PyrI4結合時,R9不僅與D74形成鹽橋作用,而且與底物的O2形成氫鍵(圖11A、B)。因此,底物誘導R9,D74之間形成穩定的氫鍵網絡,從而穩定α0。并且過渡態與α0相互作用最為強烈,在WT-TS復合物的分子動力學模擬中,R9和D74的平均接觸距離為3.0?,在反應物和產物中,R9-D74平均接觸距離分別為3.6和3.5?。這些結果也表明PyrI4和過渡態結合時,存在誘導契合/構象選擇機制。

    JACS | 量子化學計算揭示D-A環加成酶PyrI4的催化機制

    圖10.?野生型PyrI4在高溫下的熱穩定性研究

    圖片來源于:JACS

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    圖11.?R9與D74的鹽橋相互作用研究

    圖片來源于:JACS

    綜上所述,作者詳細闡明了PyrI4催化D?A反應的催化機制。PyrI4對底物的活化效應主要來源于酸催化和Q115?H117?Y85氫鍵三聯體,并且選擇性催化四種過渡態中的TS1b,底物誘導PyrI4的N端“蓋狀”結構可以穩定D-A反應的過渡態構象。

    參考文獻

    Yike Zou, et al. Computational Investigation of the Mechanism of Diels?Alderase?PyrI4.?J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 47, 20232?20239. DOI: 10.1021/jacs.0c10813.

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