先睹為快
作者? ?
中國科學院上海有機化學研究所劉文教授
美國加州大學洛杉磯分校的K. N. Houk教授
研究對象?
D-A環加成酶：PyrI4
計算方法
量子力學計算（Quantum Mechanical Calculations）
分子對接（Docking Calculations）
分子動力學模擬（Molecular Dynamics Simulations）
結合能計算（MM/GBSA Calculations）
量子-分子力學組合計算（QM/MM MD calculations）
計算軟件
XTB程序，Gaussian 09，Autodock Vina，Amber 16
計算流程
作者首先通過DFT計算了非酶參與的不同底物質子化狀態D-A反應，發現了PyrI4的酸催化效應，并通過前線軌道理論揭示其本質是降低了反應的能級差；接著，作者通過docking，MD模擬，QM/MM模擬研究了PyrI4與不同的底物狀態結合，發現了關鍵的Q115?H117?Y85氫鍵三聯體；此外，作者通過反應內稟性計算和MD模擬探究PyrI4的立體選擇性問題；最后作者對PyrI4蛋白N端的α-螺旋結構也進行了研究，揭示了這獨特的“蓋狀”結構對D-A反應過渡態的穩定作用。
引言
狄爾斯-阿爾德反應（D-A reaction，簡稱“D-A反應”）是一類能夠直接形成C-C鍵的重要有機反應，可以高效地實現對雜環、手性螺環和橋環等復雜結構的構建，也被廣泛應用在天然產物和藥物分子的合成中。吡咯吲哚霉素（pyrroindomycin，PYR）的生物合成途徑中涉及兩個D-A環加成酶PyrE3和PyrI4（圖1）。這兩個酶的晶體結構也已被報道，其中，PyrI4蛋白獨特的“蓋狀”特征。本文作者通過一系列計算的手段研究了PyrI4催化分子內D-A反應的活化效應和立體選擇性機理。研究發現，PyrI4的關鍵活化效應主要來自酸催化、構象誘導自適應機制，即由底物誘導PyrI4的N端“蓋狀”結構以穩定D-A反應的過渡態構象，產物的立體選擇性合成來源于PyrI4酶增強了底物內在的D-A立體選擇性。
圖1.?Pyrroindomycin生物合成生物途徑中涉及的D-A環加成酶
圖片來源于：JACS
研究內容——非酶參與的D-A反應的DFT研究
PyrI4催化合成吡咯吲哚霉素分子中關鍵的的螺環結構，參與圖1中的化合物4到5的過程。作者首先研究了非酶環境下不同PH值對D-A反應的影響，如圖2所示，在氣相中，4a通過exo過渡態TS1a生成5a的反應能壘高達42.2kcal/mol，將要形成的C-C鍵分別為1.8和 3.0?，這說明該環化反應高度異步（highly asynchronous），表明在過渡態形成的部分電荷可能會被極性環境所穩定。特別是，乙醚溶劑化模型（類似于酶疏水內部介電環境）將能壘降低至41.5 kcal/mol，而更為極性的水溶劑化模型將能壘進一步降低至40.0 kcal/mol。然而，目前能壘仍然太高，無法在室溫下自發反應。
PyrI4酶的第一個潛在催化作用是對tetramate的質子化。PyrI4-產物的復合物晶體結構顯示，活性空腔中富含酸性氨基酸，并且產物的tetramate結構朝向酸性空腔。作者假設PyrI4酶可以質子化內酰胺，通過酸催化加速D-A反應。作者計算了質子化后的4b通過TS1b形成5b的D-A反應能壘為28.8kcal/mol，與非催化反應相比，這種酸催化的D-A反應可顯著降低反應能壘。
為了解釋為什么PyrI4酶可以通過改變反應的電子性質，使反應勢壘降低12.7kcal/mol。作者進行了前線軌道計算（圖3），與4a相比，4b的HOMO?LUMO間隙較低，（4.6 vs 7.0 ev），因此非催化的D-A反應是一個逆電子需求的反應，而酸催化的D-A反應是一個順電子需求的反應。
圖2.?非酶參與的D-A反應的DFT研究
圖片來源于：JACS
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圖3.?不同質子化狀態下二烯烴和親二烯烴的軌道分析
圖片來源于：JACS
研究內容——PyrI4酶中關鍵相互作用的計算研究
PyrI4酶的第二個催化作用是與底物的相對高能反應構象結合。圖4展示了PyrI4酶和產物的共晶結構，底物和口袋非常緊密的契合在一起，并且口袋中極性和非極性殘基分布在產物的對立面，極性tetramate部分被親水性殘基（即E65、Y85、E87、Q115和H117）包圍，而非極性十氫萘環與疏水殘基相互作用。作者猜測蛋白口袋中親水和疏水相互作用的協調作用，導致底物先以一種合理的高能反應構象與蛋白結合，然后誘導小分子形成類似D-A反應過渡態的構象。因此，作者提出了一種激活機制，PyrI4只與處于反應性構象（近似過渡態）底物結合。在沒有酶的情況下，這種強制構象變化需要6.8kcal/mol能量（圖5），為了使這一過程自發進行，PyrI4酶必須使反應構象比馳豫構象穩定至少6.8kcal/mol。
圖4.?PyrI4酶和產物的共晶結構及相互作用示意圖
圖片來源于：JACS
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圖5.?底物構象變化的研究
圖片來源于：JACS
分子對接研究表明，4b的反應構象的對接模式與共晶體結構中的產物相似，但4b的馳豫構象不能結合到口袋(圖6)。為了進一步研究不同底物狀態與蛋白的結合力，作者用AMBER16進行了分子動力學（MD）模擬，然后應用MM/GBSA方法估算了4-RC、4-TS和4-P的結合能（?48.4、?49.2、?47.2 kcal/mo），結果表明PyrI4選擇性地穩定過渡態。
作者發現PyrI4酶的活性中心存在一個氫鍵三聯體，可以穩定TS1b過渡狀態?；谙惹皩雍蚆D研究，如圖7所示，作者構建了一個TS1b?PyrI4復合物理論酶模型（TS1b-T），包含Y85、H117和Q115形成的氫鍵三聯體，由于這三個殘基的存在，TS1b-T過渡態（18.7kcal/mol）的自由能比未催化的TS1b（22.0kcal/mol）低3.3kcal/mol。如果只把Q115殘基劃入，過渡態的能量則為21.1 kcal/mol，相差的2.4 kcal/mol來自Y85?H117?Q115氫鍵三聯體的協同效應。H117與Q115之間的氫鍵增加了Q115的酸性，使其成為更強的氫鍵供體。
圖6.?不同底物狀態與蛋白結合的研究
圖片來源于：JACS
圖7.?TS1b?PyrI4復合物理論酶模型
圖片來源于：JACS
然而，為了降低D?A反應勢壘，PyrI4酶必須選擇性穩定過渡態，作者假設Y85?H117?Q115氫鍵三聯體，只有在酶促反應進入過渡狀態時才能組裝起來。為了驗證這個假設，作者應用MD模擬了PyrI4分別結合反應物、過渡態和產物時，這一關鍵氫鍵三聯體的動力學行為。結果如圖8所示，只有當與過渡態結合時，氫鍵三聯體才能形成穩定的氫鍵網絡（4b-TS）。通過進一步殘基能量分解表明，其他殘基對反應勢壘的貢獻為0.7 kcal/mol。綜上所述，Q115?H117?Y85氫鍵三聯體將能壘降低3.3 kcal/mol，其他PyrI4殘基共同降低能壘0.7 kcal/mol。最終計算的反應自由能壘約為18 kcal/mol，與實驗kcat換算的16.7 kcal/mol一致。
綜上所述，PyrI4激活其底物進行D?A反應主要通過：（1）PyrI4質子化底物的tetramate部分，使自由能壘降低12.7 kcal/mol；（2）底物以反應構象與PyrI4結合，使自由能壘降低6.8 kcal/mol；（3）Q115?H117?Y85氫鍵三聯體選擇性穩定過渡狀態，使自由能壘降低了3.3 kcal/mol；（4）其他殘基的貢獻加合將能壘降低了0.7 kcal/mol?？偟膩碚f，PyrI4酶一共使D?A反應的能壘降低約24 kcal/mol，使該反應能在室溫下快速發生。
圖8.?Y85?H117?Q115氫鍵三聯體的MD模擬
圖片來源于：JACS
研究內容——PyrI4酶中立體選擇性問題的計算研究
隨著PyrI4酶對底物激活作用的確立，作者對PyrI4酶如何控制D?A反應的立體選擇性問題進行了研究。原則上，化合物4的D?A反應可以得到四種可能的產物。作者首先研究了這個反應的固有選擇性（圖9），結果顯示，exo產物過渡態(TS1b)比endo產物過渡態在能量上低，反應會傾向形成TS1b。為了研究PyrI4對D?A反應立體選擇性的影響，作者將四種可能的過渡態分別對接到PyrI4的活性中心。TS1b和TS4b都能與鍵殘基Q115形成氫鍵，但只有過渡態TS1b與產物結構有顯著重疊。雖然四種過渡態的結合能預測值相似，但TS1b顯示出最大的結合自由能（?12.6kcal/mol）。作者分別對四個過渡態的復合物進行了500 ns MD模擬，通過追蹤關鍵的鍵長變化，發現只有TS1b可以保持反應構象，相比之下，其他立體異構體已經馳豫為非反應構象。這些結果表明PyrI4的活性口袋已經演化成選擇性地結合底物構象，從而得到了目標產物5。
圖9.?PyrI4對四個立體異構過渡態的選擇性
圖片來源于：JACS
研究內容——特殊的α-螺旋結構（α0）的角色研究
在闡明了PyrI4的活化機理和立體選擇性的基礎上，作者進一步研究了lid在PyrI4的催化機理中的作用。PyrI4中有一個獨特結構特征即催化空腔頂部存在一個短的N-端α-螺旋（α0），稱為lid。先前的實驗突變表明，α0對PyrI4的活性至關重要，核磁共振研究表明其是高度動態的。作者先前假設α0可以捕獲柔性底物，從而促進底物結合。為了研究了底物存在與否對α0的構象變化影響，通過DSSP分析了MD模擬中α0的二級結構變化。作者首先研究了野生型PyrI4（WT）在高溫下的熱穩定性（圖10）。在apo-PyrI4（不包含底物）在373k下的1μs MD模擬中，α0分解成一個無規則的線圈（圖10C）。在373 K溫度下的模擬時間內，α0的螺旋結構占比56%（圖8A），而在室溫下，該占比為82%，這與實驗觀察結果一致，即在反應前將酶在100℃下加熱20分鐘可導致酶活性降低約50%。接下來，作者研究了底物結合后對α0的影響，當PyrI4與天然底物的反應構象結合時，α0的螺旋結構的統計含量較高（92%），并且過渡態結合時達到最大值（94%）。相比之下，apo-PyrI4（WT-apo）的α0在相同的模擬條件下顯示出較少的（82%）螺旋結構。這些結果表明，當α0與反應構象的底物、過渡態結合時，其熱力學穩定性較高。
為了解釋為什么α0與底物結合時會更穩定，作者著重研究了位于α0起始位置的精氨酸（R9）。單點突變實驗表明，突變株R9A的催化不活躍。對apo-R9A的MD模擬表明，與野生型（82%）相比，R9A的α0具有相似的螺旋含量（79%）。然而，與野生型相比(94%)，R9A-TS復合物的α0-螺旋含量較低（78%），表明底物不能像野生型那樣穩定R9A突變體的α0結構，因此，TS與R9A突變體的結合力不如WT，結合自由能計算結果也證明了這點。進一步研究了R9在催化反應中的作用，從各種MD模擬結果分析，作者發現在WT-TS復合物中R9與D74形成鹽橋相互作用（圖11），這種鹽橋作用只有在TS與WT-PyrI4結合時才穩定。在WT-apo模擬中，R9以隨機取向存在，并且大部分時間與水溶劑分子相互作用。相反，當底物與PyrI4結合時，R9不僅與D74形成鹽橋作用，而且與底物的O2形成氫鍵（圖11A、B）。因此，底物誘導R9，D74之間形成穩定的氫鍵網絡，從而穩定α0。并且過渡態與α0相互作用最為強烈，在WT-TS復合物的分子動力學模擬中，R9和D74的平均接觸距離為3.0?，在反應物和產物中，R9-D74平均接觸距離分別為3.6和3.5?。這些結果也表明PyrI4和過渡態結合時，存在誘導契合/構象選擇機制。
圖10.?野生型PyrI4在高溫下的熱穩定性研究
圖片來源于：JACS
圖11.?R9與D74的鹽橋相互作用研究
圖片來源于：JACS
綜上所述，作者詳細闡明了PyrI4催化D?A反應的催化機制。PyrI4對底物的活化效應主要來源于酸催化和Q115?H117?Y85氫鍵三聯體，并且選擇性催化四種過渡態中的TS1b，底物誘導PyrI4的N端“蓋狀”結構可以穩定D-A反應的過渡態構象。
參考文獻
Yike Zou, et al. Computational Investigation of the Mechanism of Diels?Alderase?PyrI4.?J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 47, 20232?20239. DOI: 10.1021/jacs.0c10813.