引言
自然界除了作為生命基石的20種原型氨基酸外，還有多種表現出不同生理功能的非典型氨基酸(ncAAs)，它們同樣可廣泛用作生物活性產物的中間體。一項對FDA批準的藥物的研究分析表明，在最暢銷的200種藥物中，大約12%至少含有一種ncAA構成成分。然而，盡管ncAAs具有廣闊的應用前景，但由于需要嚴格的立體選擇性和官能團相容性，其合成仍然是一個挑戰。因此，對于ncAAs來說，簡單、可持續、具有成本效益和可擴展的流程，是非常之必要的。手性ncAAs，可以通過碳-碳雙鍵的氫胺化反應得到，這是合成化學中最熱門的反應之一。此外，不對稱C-N加成在一定程度上可以很容易合成ncAAs，而且理論收率接近100%，雖然這個過程通常要求繁瑣的保護，解除保護步驟和昂貴的催化劑或手性助劑。在這種情況下，自然界通過使用氨裂解酶，來催化可逆的C-N鍵的裂解和形成，從而規避了上述缺點，比如圖1所示天冬氨酸酶(AspB)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)。
在這篇文章中，作者在基于機制計算的重設計策略下，重新設計并重新構建了天冬氨酸酶(AspB,一種高度特異性的氨裂解酶)的活性位點，生成了一種用于C-N鍵形成的多功能氫胺化生物催化劑(具有親核試劑和親電試劑交叉兼容性)，并在制備脂肪族、芳香族和非天然帶電氨基酸物質中展示了其合成價值。
先睹為快
來自中國科學院微生物研究所的吳邊等研究者，成功地重新設計了芽孢桿菌天冬氨酸酶(AspB)的活性位點。研究者試圖解決長期以來的挑戰，即通過執行計算協議，允許酶在功能上有比較大的跳躍，沿適應度遍歷非活性序列空間，從而創建出具有非原生底物交叉兼容性的酶。?
圖1. 通過氫胺化反應合成ncAAs的生物合成策略
圖片來源于Nature Catalysis.
AspB的計算重設計
AspB的反應機制的第一步是由SS Loop上的Ser318，奪取底物Asp的Cβ原子上的質子，形成的烯酸酯陰離子中間體的羧酸基通過殘基Thr101、Ser140、Thr141和Ser319形成的氫鍵網絡來穩定，同時氨基通過Thr101、Asn142和His188側鏈的氫鍵作用固定在親核口袋中。原來的α-羧酸結合口袋由殘基Thr187、Met321、Lys324和Asn326組成，這些殘基在之前的研究中被取代，以靶向不同的親電試劑。初步的胺基不對稱氫胺化實驗表明，Asn142是一個不重要的殘基，而Thr101和His188則是關鍵性的殘基(Thr101和His188被取代為丙氨酸后，引起了催化活性的顯著降低)。此外，從結構上看，殘基Ala99、Leu358和Glu362創造了一個受阻環境，以阻止較大的親核試劑進入其理想的反應姿態。
基于以上發現，研究者使用Rosetta酶設計，擴展了AspB的親核譜。具體來說，在保持酶的整體折疊性的情況下，Ala99、Asn142、Leu358和Glu362被突變為體積較小的殘基。通過分子動力學(MD)模擬，生成了一系列不同的起始點，用于Rosetta酶設計。隨后，為了提高設計庫的質量和減少篩選工作量，對Rosetta酶設計獲得的結果進行了計算篩選，以增加由多個獨立MD模擬取樣的構象空間。此外，酶-底物復合物在β-羧酸氫鍵相互作用網絡中花費的時間的比例，是用幾何標準的近攻構象(NACs)來定量的，這是接近過渡態結構的構象。因此，最后根據總能量得分、約束懲罰得分和NAC頻率，選擇少量設計進行實驗表征(具體的活性口袋重設計流程如圖2所示)。??
圖2.?AspB的計算活性位點的重設計流程圖
圖片來源于Nature Catalysis.
親核試劑與親電試劑矩陣的共軛加成
研究者首先評價了巴豆酸(1)與胺衍生物的不對稱氫胺化反應。作為計算設計的基準反應，研究者選擇了能夠為后期多樣化提供特殊機會的底物(烯丙胺，h)或具有相對較大取代基的底物(環丙胺，j)。將Ala99、Asn142、Leu358和Glu362同時替換為較小的殘基(A99替換為G, N142替換為GAVSTC, L358替換為GAVIMSTCDNH, E362替換為GAVLIMSTCDNH)，經由電腦模擬建立了B19酶的突變體庫。對1h的22種設計和1j的16種設計進行實驗驗證，鑒定出37個突變體，其中BA15設計(含A99G-N142S-T187C-M231I-K324L-N326A-L358V-E362M突變體)對1h和1j合成的特異性活性最高，在2 h內獲得了很好的轉化率(>99%)，對照實驗表明，在沒有酶的情況下，胺不與巴豆酸發生反應。如圖3所示，大多數胺被BA15有效地轉化為，具有>96%轉化率的光學純產物。對于強親核試劑乙二胺(m)，可發生弱自發反應，產物的對映選擇性下降至90% e.e。此外，進一步地結構分析表明，A99G-N142S-L358V-E362M突變，會產生更大的胺結合口袋，在保留范德華相互作用的同時，允許更大的胺基團以不同的方向結合(圖3)。因此，除了簡單氨外，還可以接受帶有帶電或大取代基的非天然胺。更重要的是，考慮到親核口袋的構象變化與親電子口袋的不沖突，這就意味著親核口袋和親電子口袋可直接結合。
為了評價親核口袋和設計的親電子口袋的相容性，研究者將重新設計的親核結合口袋引入了AspB野生型(AA15設計包含A99G-N142S-L358V-E362M突變)、工程酶P1 (PA15設計包含A99G-N142S-T187C-M231I-K324L-N326C-L358V-E362M突變)和F29 (FA15設計包含A99G-N142S-L358V-E362M突變)A99G-N142S-T187C-M231V-K324I-N326C-L358V-E362M突變)中，來催化多種親核供體到親電子受體的共軛加成。如預期的那樣，含乙基的不飽和氨基酸與評價的胺，進行了有效的氫胺化反應，不僅得到了相應的產物，而且它們的轉化率(>94%)和對映選擇性(>99% e.e.，2m除外)也都不錯。對于芳香底物，由于其溶解性低，必須使用較低的濃度。取代基相對較小的胺的轉化率較低。盡管如此，肉桂酸被證明是甲氧胺的有效偶聯伙伴，使產品轉化率達到97%。帶有吸電子基團/供電子基團的芳香丙烯酸酯也提供了理想的產品，具有令人滿意的轉化率，這表明重新設計的酶，可以耐受各種通常在藥物制劑中遇到的功能化基團。
圖3. 計算重設計的AspB的催化底物范圍
圖片來源于Nature Catalysis.
討論
在現有的酶工程中，理論和計算方法已經證明，其可以成功地提高人類識別酶的卓越性能起源的能力。通過探索巨大序列空間中的一小部分，已經有一些成功的研究案例，聚焦于重塑活性位點，以適應單個底物。然而，很多生物催化劑，如C-N裂解酶，亞胺還原酶和醛縮酶，卻是催化多底物的交叉偶聯。因此，問題是，是否合理的計算模型可以適用于更具有挑戰性的任務，其中酶的操作不再局限于一小組殘基，而是擴大到處理集體突變同步排列的整個活性位點。在這里，研究者通過改變極其特殊的酶AspB的底物識別模式，來解決上述的挑戰。這一目標是通過基于機制的計算協議實現的，通過分析與結合和催化相關的鄰近相互作用，從結構分析和MD模擬中檢索基本的催化幾何準則，并且允許在序列空間中有較大的跳躍，同時容納多個同時發生的突變和底物之間的相互作用。這一策略的顯著優勢，在于盡量減少實驗，同時保持對突變間協同作用的探索。改造后的酶擁有多達8個突變分別涉及空間相鄰的位置以及活性位點。顯然，如果沒有計算的幫助，這種酶活性位點的大規模修飾，要么通過艱巨的理性的檢查，要么通過極其勞動密集型的實驗分子進化。
展望與結論
綜上所述，研究者提出了一種通用的可構造C-N裂解酶的平臺，研究者預計，這種有效的生物催化劑優化平臺的進一步發展，可能會打開新的機會，使結構多樣的構建塊通過C-N連接，用于ncAAs及其衍生物的合成。因此它不僅在合成化學和藥物化學中提供了用途，而且為未來合成生物學的發展奠定了分子基礎。
參考文獻
Cui, Y., Wang, Y., Tian, W., Bu Y., Li T., Cui, X., Zhu, T., Li, R., and Wu, B., Development of A Versatile and Efficient C–N Lyase Platform for Asymmetric Hydroamination via Computational Enzyme Redesign, Nature Catalysis, 2021, 4, 364-373. DOI: 10.1038/s41929-021-00604-2.