引言
癌癥特異性代謝改變過度激活了哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的激酶活性，以克服壓力環境。雷帕霉素能夠變構抑制mTOR復合物1(mTORC1)，已經被批準用作抗癌治療藥物。然而，雷帕霉素類化合物的免疫抑制副作用會促進腫瘤轉移，從而限制了它們的治療效果。在此，本文作者通過計算機虛擬篩選結合細胞實驗首次報道了一種nonrapalog抑制劑——WRX606。文章研究表明，WRX606與mTOR的FK506結合蛋白12(FKBP12)和FKBP-雷帕霉素結合結構域(FRB)形成三元復合物，導致mTORC1的變構抑制。WRX606不僅可以抑制核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)的磷酸化，還可以抑制eIF4E結合蛋白1(4E-BP1)的磷酸化。因此，WRX606能夠在不促進腫瘤轉移的情況下有效地抑制小鼠的腫瘤生長。這些結果表明，WRX606是一種有效的先導化合物，可以進一步用于開發新的抗癌藥物。
背景介紹
代謝重編程或癌癥特異性代謝改變是由癌細胞中的致癌信號介導的。癌細胞中的異常信號會加速mTOR復合物1 (mTORC1)和mTOR復合物2(mTORC2)的活動，以克服壓力性的癌癥微環境。mTORC1通過eIF4E結合蛋白1(4E-BP1)和核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)的磷酸化來控制蛋白質合成和細胞增殖，以響應營養物、能量和生長因子的環境水平。mTORC2通過磷酸化蛋白激酶AKT、PKC和SGK來調節細胞存活、細胞周期和細胞骨架組織。
雷帕霉素(rapamycin)是從吸水鏈霉菌中分離出來的一種抗真菌大環內酯類藥物，后來發現它可以通過變構抑制mTORC1來抑制哺乳動物的腫瘤生長。然而，臨床前試驗表明，這種對mTORC1或mTORC2的變構抑制作用很快會被耐受。與雷帕霉素一樣，催化抑制劑在長期給藥過程中也存在典型的缺點，即可能導致mTORC2激活。此外，同時兼具PI3K和mTOR雙重抑制模式的抑制劑，如PI-103，對正常細胞顯示出細胞毒性，表明其治療范圍有限。因此，需要一種新的抑制劑來解決當前mTOR抑制劑的缺點。
本文研究旨在結合使用計算機和細胞篩選的混合策略發現mTORC1的新變構抑制劑?；诶着撩顾嘏cmTOR的FKBP12和FRB相結合的復合物的晶體結構，作者通過分子對接對來自ZINC15數據庫的虛擬文庫進行了虛擬篩選，并通過基于分裂熒光素酶的細胞測定進一步分析結果，最終共鑒定得到了13種具有共同骨架的類似物。13種化合物之一的WRX606可以很好地與mTOR的FKBP12和FRB進行三元絡合。此外，作者使用拉伸分子動力學(SMD)和基于細胞的點突變實驗進一步闡明了WRX606進行三元絡合的分子機制，結果表明WRX606的喹唑啉-2,4-二酮和丁酰胺基團與FKBP12形成氫鍵，而苯并二惡醇和3-氯苯氨基通過疏水相互作用與FRB相互作用。正是這些相互作用促成了FKBP12-WRX606-FRB三元復合物的形成，從而變構抑制了mTORC1，進而達到了抑制腫瘤生長的目的。相關研究以“In Silico and In Cell Hybrid Selection of Nonrapalog Ligands to Allosterically Inhibit the Kinase Activity of mTORC1”為題發布在著名藥物化學雜志JMC上。
FKBP12/FRB結合配體的初步篩選
基于物理特性，從ZINC15數據庫中制備了三個不同的虛擬配體庫子集(L#1、L#2 和 L#3，總共659417個化合物)。所有對接均使用FKBP12-雷帕霉素-FRB三元復合物晶體結構(PDB：1FAP)在ICM-Pro軟件上進行(圖 1A)。雷帕霉素分子被用作對接模板，使用原子屬性場(APF)引導配體結合到對接位點。通過用丙氨酸替換一對側鏈的方法(掃描和優化，SCARE方法)引入了對接袋中的側鏈靈活性，以提高對接的精度。結果表明，L#3(Mw > 500 Da)的對接得分通常比L#1和L#2中分子量較小配體的分數要好(圖1B)。此外，使用ICM化學性質計算器對排名前三的配體，即來自L#2的ZINC32928513(WRX513；圖1C)和來自L#3的ZINC100492939(WRX939；圖1D)和ZINC8593606(WRX606；圖1E)進行泛分析干擾化合物過濾(PAINS)，結果表明它們都是非PAINS干擾化合物，并顯示出一定程度的藥物相似性。進一步使用NanoBiT(圖1F)進行細胞測定，結果表明WRX606誘導了三元復合物的形成，而WRX513和WRX939則沒有(圖1G)。需要強調的是，在對接模型中，這三種配體以不同的模式與FKBP12和FRB相互作用(圖1H-J)。
WRX606類似物的選擇
使用WRX606的通用骨架，作者進一步鑒定了12種類似物(圖2A)。所有這些類似物也是非PAINS干擾化合物。使用NanoBiT分析發現另一種類似物WRX601也可以增強三元復合物的形成，但其親和力比WRX606弱(圖2B)。進一步的定量分析(即通過細胞內檢測系統對WRX606、WRX601和雷帕霉素進行滴定)結果表明WRX601比WRX606結合FKB12/FRB的能力弱兩倍(圖 2C)。分析對接模型發現，由于構象變化，WRX601沒有與Y2104結合，從而導致在FKBP12位點缺乏與D37相互作用的氫鍵(圖2D-F)，進而導致上述差異。
最后，為了驗證WRX606和WRX601的對接模型，作者在它們與FRB和FKBP12 的預測結合殘基處進行了點突變(圖3A-F)。其中，D37A、I56A和Y82A的點突變位點位于FKBP12的配體結合口袋中；S2035A、Y2038A、F2039A、T2098A、W2101A、Y2104A和Y2105A位于FRB的配體結合口袋中?？梢钥吹?，D37A、Y2038Y和Y2104A的點突變對WRX601結合的影響小于WRX606，表明當3-苯氨基位置(WRX606)上的氯原子被一個氫原子取代后，配體的結合模式就會不同?？傮w而言，點突變實驗驗證了對接模型，表明WRX606在細胞水平上比WRX601更容易與FKBP12和FRB形成三元復合物。作者最后還分別驗證了WRX606作為S6K1和4E-BP1的變構抑制劑在癌細胞中發揮的主要作用，結果表明WRX606能夠抑制S6K1和4E-BP1兩種底物的磷酸化，而雷帕霉素和WRX601僅微弱地抑制4E-BP1的磷酸化。此外，WRX606在任一激活條件下對癌細胞均顯示出顯著的細胞毒作用，比對非癌細胞強100-1000倍，表明WRX606具有較好的抑制癌細胞生長的效果。
圖表匯總
圖 1. 虛擬篩選發現與FKBP12和FRB形成三元復合物的配體。圖片來源于JMC
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圖2. 基于通用骨架選擇WRX606類似物。圖片來源于JMC
圖3. WRX606與FKBP12/FRB界面的結合比WRX601更強。圖片來源于JMC
結論總結
mTOR已被用作各種癌癥的治療靶點。本文通過計算機和細胞混合篩選的策略發現了一種非雷帕霉素類變構抑制劑——WRX606，其通過同時靶向mTORC1的FKBP12和FRB來實現配體選擇。因此，所選化合物WRX606是第一個通過與FKBP12和FRB形成三元復合物而變構抑制mTORC1的非雷帕同系化合物。然后，作者證明WRX606能夠顯著抑制mTORC1的底物S6K1和4E-BP1的磷酸化，進而導致癌癥細胞毒性?？傊?，這種新型的mTORC1變構抑制劑擴展了進一步發現和開發專門針對mTORC1的抗癌療法的平臺。
參考文獻
Shams R, Matsukawa A, Ochi Y, Ito Y, Miyatake H, In Silico and In Cell Hybrid Selection of Nonrapalog Ligands to Allosterically Inhibit the Kinase Activity of mTORC1, J. Med. Chem., 2021, ASAP. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c00536.