SARS-CoV-2的突變體是如何影響RBD-ACE2復合物的形成的呢？原子力顯微鏡和分子動力學模擬揭示了關于SARS-CoV-2突變體結合的原子細節，為了解病毒突變對感染誘導免疫的影響提供了見解。
背景介紹
目前世界上已經開發了幾種有效預防COVID-19的疫苗，但是突變的SARS-CoV-2不斷出現，迅速傳播的突變體表明這種病毒可以輕松適應其刺突蛋白（S蛋白）的抗原變化，而不失去任何適應能力。目前幾乎所有與病毒復制的分子和細胞細節、病理和毒性相關的機制認識都是通過早期SARS-Cov原型產生的。
一些SARS-Cov-2的突變負責大型構象變化,可能會加重感染,另一些位于受體結合基序(RBM)的突變增強了對ACE2受體的識別，并影響單克隆抗體(mAb)的中和效率。
RBM是位于SARS-CoV-2三聚體刺突頂部的受體結合域(RBD)的一部分(圖1a, b)，是目前使用的COVID-19疫苗誘導的中和抗體的主要靶點。RBM作為病毒的主要受體，負責結合血管緊張素轉換酶2 (ACE2)。但RBM對突變非常耐受(圖1c)，許多突變并不影響甚至增強與人ACE2受體的結合，可能對抗體識別有害。例如，N501Y，出現在Alpha、Beta和Gamma變體中，增加了ACE2結合。這種RBM抗原變異造成禮來公司的bamlanivimab單抗從治療COVID-19患者的單藥緊急使用批準中撤出，因為帶有E484K/Q突變的VoCs已經耐藥。
文中，作者利用原子力顯微鏡結合分子動力學，在原子水平上更好地了解刺突蛋白突變對刺突-受體相互作用的影響以及它對抗體抑制作用的影響，對后期的研究至關重要。
VoCs RBD與ACE2具有強結合
為了檢測受關注的SARS-CoV-2變種（VoCs）是否以更高的親和力結合ACE2，作者使用基于力曲線（FD-curve）的原子力顯微鏡（AFM），將純化的Alpha-、Beta-、Gamma-和Kappa-RBD的結合與WT-RBD的結合進行了比較(圖1d)。為了研究結合潛力，RBD修飾的尖端被循環接近并從ACE2表面縮回。對作用于功能化尖端和表面之間的力的變化進行監測，產生的力與時間的曲線如圖1e所示。觀察到的較高的結合頻率表明，與WT相比，VoCs與ACE2的結合更容易，與觀察到VoCs的較高的傳播率一致。
圖1. 通過原子力顯微鏡和分子動力學模擬對SARS-CoV-2突變體與ACE宿主受體的結合進行量化。?圖片來源：Nat. Commun.
VoCs-RBD-ACE2的熱力學
使用基于FD的 AFM，作者通過對鍵施加外力(F)來測量RBD-ACE2配合物的結合強度，并使用Bell?Evans模型提取了相互作用的動力學性質，以預測配體-受體鍵的結合強度與加載速率的對數之間的線性關系(LR為隨時間推移，鍵上的力負荷)。對不同LRs下測量的力進行了分析 (圖2b-f)。在WT-RBD或VoCs-RBD與ACE2受體相互作用時，發現都與過渡態的距離相似，表明在這些條件下結合口袋的幾何形狀/位置相似。
當解離率減小到零時，檢測到Gamma-RBD Koff最小，其次為Kappa。接著從?Koff（τ=Koff?1）計算單分子鍵的壽命τ。作者觀察到William-Evans預測的與記錄的單分子數據之間有良好的相關性。這一觀察結果強調了病毒粒子在附著于細胞表面受體過程中的重要作用。病毒粒子上高密度的RBD有利于形成多個鍵，從而增強病毒?宿主相互作用的表觀壽命。
在單分子水平上，通過復合物的解離常數KD可以得到更準確的整體鍵壽命圖。例如，高親和相互作用的壽命較長，因為KD被定義為Koff與復合物形成的動力學速率(kon)之比。實驗中，假設受體鍵復合物的形成可以用偽一級動力學近似，kon可以從不同保持時間測量的結合頻率(BF)中提?。▓D2b-f，右圖）。計算的平衡解離常數KD(koff/kon)：Gamma (KD=21±16nM) < Kappa (KD=71±31nM) ≤ Beta (KD=80±49nM) ≈ Alpha (KD=129±81nM) ≈ WT (KD=134±81nM)。KD對應于高親和力的相互作用，證實了SARS-CoV-2與其同源ACE2受體建立的復合物的高親和力和穩定性。
體外實驗表明，出現的VoCs，特別是Gamma和Kappa VoC，具有相似或更好的ACE2受體結合能力。VoCs的持續出現似乎是一種向更高穩定性的復合物的進化，同時插入了可以避免恢復期血清或疫苗衍生血清中和的關鍵點突變。
圖2 通過AFM測量RBD突變體對其ACE2宿主受體的親和力。圖片來源：Nat. Commun.
RBD-ACE2配合物的能量分析和結構穩定性
為了闡明在VoCs中觀察到的RBD-ACE2復合物的更高穩定性的分子機制，作者進行了MD模擬。使用GROMACS軟件包對完全溶劑化的RBD-ACE2配合物進行了累積7.5μs的全原子MD模擬(圖3a)。在能量最小化步驟和模擬箱的平衡之后，對每個系統進行了5個具有250ns無約束MD模擬的重復和分析。在每個模擬中，各RBD-ACE2復合物是動態的但結合保持穩定，每個RBD測試的初始平衡結構的Cα均方根偏差(RMSD)小于10?，且VoCs相對于WT的根均方根波動(RMSF)變化較小。
作者首先比較了RBD-ACE2配合物的總能量。對于WT配合物來說，RBD和ACE2之間的勢能，即分子間長程庫倫和蘭納-瓊斯勢相互作用的總和，在?590.22kJ/mol左右。在研究的4個VoCs中，只有Kappa變體顯示出更穩定的結合復合物，總能量降低了15.2kJ/mol(圖3b)。通過觀察界面能，其他三個VoCs(Alpha，Beta，Gamma)的蘭納-瓊斯勢比WT參考能量增加約10 kJ/mol，被更多分子鍵穩定 (圖3c)。在模擬過程中，觀察到一些新的分子間接觸的形成、斷裂和重新生成，主要是在RBD殘基484和501附近的區域 (圖3d，e，f)。
圖3. WT和VoCs的RBD-ACE2的MD模擬。圖片來源：Nat. Commun.
對點突變的精細能量分析顯示了WT和VoCs之間的重要差異（圖4）。每個單獨的突變都可以影響與ACE2的結合，但也可能與局部構象和穩定性擾動相關。N501Y突變在三個突變體(Alpha、Beta和Gamma)中很常見，似乎在能量方面具有最大的影響。這一突變通過新的接觸強烈增強了RBD和ACE2之間的相互作用。缺乏N501Y突變的Kappa突變體顯示出與WT SARS-CoV-2相似的能量。
圖4. 通過MD模擬進行RBD點突變能量分析。圖片來源：Nat. Commun.
隨后，作者分析了由點突變導致的RBD-ACE2復合物保守殘基的能量變化（圖5），WT和Kappa的Q498殘基與ACE2中的K353保持接觸，而該接觸在其他突變體中丟失。這種效應與具有最低總能量和蘭納-瓊斯勢的局部環境相關(圖5g，h)。Y505-E37接觸點的強度在Alpha和Beta中下降，并在Gamma和Kappa中恢復。而Kappa與ACE2 β-發夾(K353-G496和K353-Q498)出現了兩個高頻率的接觸，在ACE2和RBD之間提供了一個更大、更穩定的界面(圖5i，j)。
另外，大多數接觸點位于RBD-ACE2界面內的ACE2 β-發夾附近，這在Kappa變體中更加穩定(圖5a)。這一過程可以被看作是在AFM中自發解除結合或在加載力下的過程中的關鍵，因為它可能使ACE2在界面的一側錨定更長的時間。
圖5. 由于VoCs點突變而導致的RBD-ACE2復合物保守殘基的間接結構和能量變化。圖片來源：Nat. Commun.
突變的殘基對VoCs中RBD-ACE2的穩定起著動態作用
在WT中，鹽橋K417-D30是具有freq~0.7的高頻集的一部分。同樣的接觸在freq~0.9的Alpha變體下更持久，Beta的K417N突變和Gamma的K417T突變接觸頻率下降到0.4以下，這與界面能中靜電貢獻的急劇下降有關。對于Kappa變體，鹽橋再次建立了更高的freq~0.85。
殘基452沒有與ACE2受體建立任何高頻接觸，然而，它與WT中的349、350、351、492和493殘基進行了6次高頻鏈內RBD接觸。在Kappa突變體中，這些接觸的波動減少，使RBD更加穩定。從能量表征(見圖4c，d)來看，WT RBD-ACE2界面能和VoCs的總能量和vdW能量的平坦輪廓與452殘基中該突變介導的接觸缺失相一致。
殘基484形成了一組非常動態的鹽橋相互作用，這解釋了在界面上的總能量沒有顯著增加的原因。在WT中，E484與K31形成了一個穩定的相互作用，用一個鹽橋和少量的強氫鍵(HBs)表示。這種相互作用在Alpha變異中不會被突變N501Y所破壞；相反，在ACE2中的一個穩定的疏水接觸Y501-Y41被重組。對于Beta，Gamma及Kappa突變體，在殘基484突變下，鹽橋丟失，但在Beta和Gamma變體中形成了一個具有ACE2的新鹽橋K484-E75，在RBD-ACE2界面上提供了額外的靜電穩定。
對于WT，殘基501與ACE2形成高頻接觸(freq~0.8)，用N501-Y41表示。Alpha、Beta和Gamma變體中相同的殘基形成了更穩定的疏水接觸，因為吸引的π-π相互作用的頻率分別為0.94、0.97、0.98，這是由vdW能量證實的界面穩定的標志(圖4j)。然而，這種接觸成為Kappa變體中的低頻率(freq<0.7)集的一部分。N501Y突變更為動態，并建立了不止一個的在VoCs中的相互作用，這并沒有體現在WT中?？傊?，Alpha、Beta和Gamma突變體中的N501Y突變似乎加強了Y501-Y41接觸的頻率。
針對SARS-CoV-2的RBD的抗體可作為COVID-19的潛在治療方法
作者使用單分子力譜方法測試了兩種IgG1單抗(B-K45和B-R41，Diaclone SAS，法國)針對WT RBD的結合抑制效率（圖6）。定量比較RBD抑制水平的結果顯示IC50在在μg/mL范圍內。這表明B-K45雖然從WT-RBD免疫小鼠中獲得，但卻更有效地抑制了VoCs-RBD與ACE2的結合。
而對于B-R41，只有RBD WT和Alpha變體與ACE2受體的結合可以被有效地抑制(IC50在1 μgmL?1)。其他的RBD變體(Beta、Gamma和Kappa)在B-R41存在的情況下仍然能夠與受體結合，但BF減少了20-30%。結果表明針對WT-RBD的單克隆單抗也可以抑制被測VoCs的結合。然而，根據對B-R41單抗的觀察，VoCs可以逃脫這種中和，可能是E484突變的結果，因為顯示抑制減少的三種變異(Beta、Gamma和Kappa)共享這種特殊的突變。
圖6. 研究抑制不同RBD突變體與ACE2受體結合的抗體效率。圖片來源：Nat. Commun.
討論
本文基于原子力顯微鏡結合分子動力學對SARS-CoV-2的突變如何定量地影響RBD-ACE2復合物形成的動力學、熱力學和結構特性展開了研究。結果觀察到RBD-ACE2復合物的穩定性顯著增加。雖然N501Y和E484Q突變對更大的穩定性尤為重要，但N501Y突變不太可能顯著影響抗體中和。這項工作提供了關于SARS-CoV-2變異結合的前所未有的原子細節，并有助于了解病毒突變對感染誘導免疫的影響，揭示了RBD作為強有力的抗病毒靶點的潛力。
參考文獻
Koehler M, Ray A, Moreira RA, Juniku B, Poma AB, Alsteens D. Molecular insights into receptor binding energetics and neutralization of SARS-CoV-2 variants. Nat Commun. 2021 Nov 30;12(1):6977. doi: 10.1038/s41467-021-27325-1. PMID: 34848718; PMCID: PMC8633007.