MixMD發現了PD-1全新的可藥空腔，并通過虛篩得到結合于該空腔的名為1508的新型配體，為探索靶向PD-1?PD-L1復合物的癌癥治療提供了替代方案。
背景介紹
在過去的幾年里，癌癥免疫治療引起了越來越多的關注。程序性細胞死亡蛋白1 (PD-1)通過調節T細胞功能促進自我耐受并抑制免疫反應。PD-1和程序性細胞死亡配體1 (PD-L1)之間的相互作用導致免疫衰竭，保護癌細胞免受破壞。目前針對PD-1靶點以阻斷PD-1和PD-L1作用的主要為單抗，少見有小分子藥物。
在本研究中，作者用計算方法設計了一種名為1508的新型小分子配體，并且該配體與MixMD識別的全新的PD-1空腔結合，發現了PD-1中新的可藥空腔。作者通過一組12.5 μs的MD模擬表明，配體1508分別與氨基酸殘基Lys78和Arg86形成頻繁的陽離子?π和氫鍵作用，并以不利于PD-1?PD-L1配合物形成的構象穩定PD-1 C’D環。這項研究強調了MixMD在暴露易受蛋白-蛋白復合物抑制的新腔體方面的能力，并為設計針對PD-1 C’D腔體的新分子奠定了基礎，作為探索PD-1-PD-L1復合物在癌癥治療中的調節的替代方案。
結果
C’D環中新型/前所未有的疏水腔的識別
首先，作者通過有機探針的MD模擬（MixMD）和接觸計算在PD-1中尋找新的相互作用位點，并發現含有芳香環或帶正電基團的分子很容易被識別并對PD-1有一定的親和力。
PD-1負責與PD-L1蛋白相互作用的前片被芳香探針明顯識別(圖1A,B)，支持MixMD識別PD-1表面已知空腔和相互作用位點的能力。此外，對突出的探針之間的結果進行聚類和比較，可以確定所有探針都訪問的一個顯著的公共區域–覆蓋PD-1的C’D loop環。loop環被認為是分子識別的關鍵，C’D loop環通過氫鍵和鹽橋與pembrolizumab抗體重鏈的CDR相互作用，有助于復合物的穩定。
PD-1PD-L1和PD-1benzene(replicate 6,REP6) MD模擬中兩個最終MD結構的重疊證明了探針占據了C’D環路區域，靠近PD-1和PD-L1的主界面。此外，由于探針的存在，可以觀察到該區域發生的構象變化。為了研究探針是如何進入空腔的，作者定義了C’D環周圍苯的五種最具代表性的狀態，并將其描述為與關鍵環殘基的距離函數。作者發現了兩個基團，一個被定義為結合態，用構象狀態1表示，另一個被定義為接近非結合態，用構象0、2、3和4表示(圖1C)。芳香探針在狀態1的普遍存在主要是由于Leu79、Ala80、Ala81、Phe82、Pro83、Pro89、Gly90和Phe95殘基的存在，這些殘基的疏水性和芳香側鏈可以與探針正常相互作用。
此外，帶負電荷的殘基(如Asp77、Glu84、Asp85和Asp92)的存在可能通過鹽橋的建立有利于甲基銨在該區域的固定。束縛態構象中苯的存在導致C’D環形成一種構象，這種構象在腔內沒有探針的情況下是不經常被訪問的(圖1D)。環的剛性隨探針引起的構象變化而變化，表現出一種可能的構象選擇現象。這些發現鼓勵作者去尋找與這個腔體結合的小分子。
圖1. MixMD結果及分析。圖片來源：JCIM
虛擬篩選揭示能與C’D環路中的空腔相互作用希望分子
將Enamine REAL數據庫的初始預處理(圖2A)產生的約17 M分子用于對接分析。使用fpocket軟件描述了PD-1benzene配合物replicate 6的空腔體積，并確定了對接初始結構的選擇。該結果與之前獲得的相同復合物的PCA值一起分析，表明該位點探針的存在能夠穩定環路的開放構象，使其保持在高容量平臺上。由于PD-1具有較大的空腔開口(982.24 ?3)和對苯的適應能力(構象狀態1)(圖2B)，作者選擇了用于篩選的初始PD-1結構。這樣一個結構位于靠近主成分分析（PCA）中心的位置(圖1D，結合狀態)，位于與未結合狀態覆蓋的區域相反的位置。VS步驟使得選擇10個與提議的相互作用位點可能有親和力的配體成為可能(圖2C)。大多數配體的△G預測值在-6.9 ~ -6.0 kcal/mol范圍內。通過對第一輪VS的可視化分析發現，具有芳香環的配體在相互作用和占據結合位點方面具有優勢。
根據結合能評分和配體效率篩選出最佳的10萬個配體進行集成對接實驗。為這一步選擇的蛋白質結構必須適應C’D環腔中的探針，同時也要彼此構象不同。因此，進行PCA，只考慮PD-1benzene配合物replicate 6的腔內探針(構象狀態1)的幀。因此，可以根據它們在PCA結果中所占的象限選擇10個結構編號。
根據平均結合能和配體效率考察了500個最佳配體，以追蹤它們與PD-1的C’D環的相互作用。芳香基團再一次在選擇的配體中發揮了重要作用。此外，酰胺基團的明顯重要性被觀察到，因為大多數配體在其結構的中心部分有這個基團。為了覆蓋大部分重要的化學空間，作者通過改變芳香基團和體積較大基團的數量來選擇結構，避免選擇具有類似化學支架的結構。最后，作者選擇了沒有酰胺基的分子，以驗證這個基團在穩定配體中的重要性。所有配體都通過了ChembioServer 2的毒性測試。?
圖2. 揭示PD-1 C’D loop環高親和力配體的步驟流程。圖片來源：JCIM
MD模擬揭示C’D環位點配體的穩定性和結合模式
對于短MD，其中5個配體保留在C’D空腔內顯示dLig-Site至少有4個replicate在9 ?以下。這些分子共享一個中央酰胺基，通過與Arg86、Leu79、Ala81和Ser87相互作用起到錨定作用。配體3036與那些突出的分子具有相似的結構，但沒有表現出相同的穩定性，這可以通過吡喃吡唑基4號位的氟原子和氫原子造成的空間位阻阻止了酰胺作為給氫基團，損害了氫鍵的建立，從而導致配體的不穩定性進行解釋。為了使配體-蛋白相互作用結果更有說服力，作者進行了第二輪短MDs，證實了配體1508、8704、2810相互作用的穩定性。對這三種配體進行了更具體的ADMETox檢測，結果證明所選分子之間沒有毒性，且具有良好的藥代動力學特性。
在重復5次長MD后，每個復合物的行為和相互作用都得到了更好的表征。配體1508表現出微小的均方根偏差(rmsd)變化(約4?)(圖3)，在整個模擬過程中都保持在相互作用位點。?
圖3. 在5x500ns MD模擬中，最穩定的配體的均方根偏差。圖片來源：JCIM
通過對相互作用圖（圖4）的分析，作者初步驗證了位于C’鏈和配體芳香基團上的Lys78的陽離子?π相互作用。這些相互作用證實了芳香基團對該區域分子相互作用的重要性。值得注意的是，盡管被認為是一種強相互作用，但與陽離子和富電子π系統的性質以及它們之間的距離相關的因素可以損害和削弱這種類型的相互作用。作者還驗證了涉及位于配體中心區域的酰胺的氫鍵的建立，證明了該基團在穩定腔內分子方面的重要性。
圖4. 在MD模擬過程中涉及三個最穩定的配體的相互作用分析。圖片來源：JCIM
隨后，作者對配體在該位點上的相互作用進行了更詳細的分析，如圖5。觀察結果表明，末端官能團的存在，取決于它們的大小和方向，可能最終會導致涉及配體中心酰胺的相互作用的喪失。通過分析，作者指出了不同類型的相互作用對于穩定腔體內配體、識別分子靶點和配體的分子的重要作用。
圖5. 通過在整個模擬過程中測量原子的距離來評估配體/PD-1相互作用的發生。圖片來源：JCIM
PD-L1在PD-1界面上的相互作用可能受到提出的新C’D空腔中配體存在的影響
涉及PD-1和PD-L1之間的界面區域(CC‘到C’)的PCA，使驗證該區域提議位點上配體存在的影響成為可能。作者隨后對PD-1H2O、PD-1PDL1和PD11508的前β-面(AGFCC‘β-鏈)殘基所覆蓋的構象空間進行了比較分析，發現，盡管配體的存在并沒有改變apo形態的覆蓋空間的整體形狀，但大多數可訪問構象的中心會略微移向PD-L1覆蓋空間的相反方向。
在所有模擬系統中考慮CC’/C’D環和C‘鏈的進一步分析表明，所有三種配體都以PD-1 apo模擬描述的整個景觀中一個非常特定的構象(PC1和PC2的略負值)凍結了loop環(圖6)。PD1PDL1復合物在PC1 < 0時幾乎沒有達到特定的構象，而是覆蓋了與ψ84二面體高度相關的PC2值的很大范圍。這意味著配體配合物所選擇的C’D環的構象對于PD-L1配合物是禁止的。在最后一個復合物中形成“排除”區的主要原因似乎是PD-1的C’D環殘基與PD-L1的F鏈、FG環和N端殘基所采用的構象之間的潛在沖突。
圖6. 由于在C’D環上所提出的配體的存在而產生的構象選擇。圖片來源：JCIM
小結
參考文獻
Andrade L, Albuquerque A, Santos-Costa A, Vasconcelos D, Savino W, Sartori GR, Martins Da Silva JH. Investigation of Unprecedented Sites and Proposition of New Ligands for Programmed Cell Death Protein I through Molecular Dynamics with Probes and Virtual Screening. J Chem Inf Model. 2022 Feb 24. doi: 10.1021/acs.jcim.1c01122. Epub ahead of print. PMID: 35202544.