JCIM | 有效抗結核分枝桿菌DNA促旋酶抑制劑的發現

背景

結核病(TB)是一種由結核分枝桿菌(M. tuberculosis)引起的具有全球影響的傳染病，它主要攻擊肺部（肺結核），但也會影響其他部位（肺外結核?。?，主要傳播途徑為呼吸道傳播和消化道傳播。據估計，全球約有四分之一的人口感染了結核分枝桿菌。結核病的治療受到耐藥菌株傳播的阻礙，包括耐利福平結核病和多藥耐藥結核病，因此急需新的抗結合藥物來解決耐藥性。2020年，兩種新的化合物(TBAJ-876和GSK-286)已進入結核病臨床開發管道的I期試驗，結核病臨床開發的化合物總數達到14個，其中8種作用于5個新的結核病靶點。

DNA拓撲異構酶II在許多在原核生物和真核生物中管理DNA（重）組織的細胞事件中發揮著重要作用。在大多數細菌中有兩種II型拓撲異構酶，DNA促旋酶( Gyrase )和DNA拓撲異構酶IV(Topo IV)。但結核分枝桿菌只編碼DNA促旋酶，并通過使用ATP作為輔助因子將負超螺旋引入DNA來控制DNA拓撲結構。DNA促旋酶由兩個亞基組成，DNA促旋酶A(GyrA)和DNA促旋酶B(GyrB)，它們結合形成一個具有催化活性的異源四聚體復合物(GyrA2GyrB2)。近期，結核分枝桿菌DNA促旋酶的四聚體復合物結構被解析，為基于此酶結構的小分子藥物設計提供了結構信息。

DNA促旋酶已被驗證為氟喹諾酮類藥物(FQs)的酶靶點，FQs是用于治療多藥耐藥結核病的二線抗生素。DNA促旋酶DNA結合位點周圍的突變導致結核分枝桿菌出現FQ耐藥性；抑制DNA促旋酶ATP酶活性是克服這一問題的一種策略。本文利用虛擬篩選結合濕實驗的方法，從化合物庫(www.specs.net)中篩選出了結核分枝桿菌DNA促旋酶ATP酶活性的候選抑制劑。隨后使用分子動力學模擬分析了其藥效團，為向DNA促旋酶發揮作用的抗結核藥物設計奠定了基礎。

虛擬篩選

虛擬篩選的流程如圖1 所示。得分最高的30個化合物與GyrB ATP結合口袋結合的Glide XP得分在-3.2~-7.2 kcal/mol范圍內。作者先將它們作為命中（Hit）化合物收集。其中，10個化合物(G01、G07、G08、G10、G13、G19、G24?G27)是同時具有S和R構型的手性分子。對這些分子也計算了S和R構型分子的Glide XP分數。

圖1. 發現有效DNA促旋酶抑制劑的虛擬篩選工作流程。圖片來源：JCIM

抗結核活性

以DNA促旋酶抑制劑新生霉素為參考化合物，作者對30種命中化合物對無致病性的H37Ra結核分枝桿菌的最低抑制濃度(MIC)進行了初步評估，以降低實驗成本和生物安全的嚴格要求。不幸的是，所有命中化合物都在7H9GC培養基中沉淀，推測溶解度可能受到其高親脂性的限制。Swiss ADME計算的單個命中化合物的MlogP值在1.19?4.15范圍內，高于可溶于7H9GC培養基中的新生霉素（0.65）。檢測的化合物中，G24和G26（圖2）的MIC值均為12.5μg/mL，表明它們對結核分枝桿菌的活性明顯高于新生霉素 (MIC>100μg/mL)。據此，作者測定了二者對H37Rv結核分枝桿菌生長抑制作用的MIC值。結果表明，G24和G26對H37Ra、H37Rv結核分枝桿菌表現出相同的MIC值(12.5μg/mL)。因為30個命中的化合物是基于Glide XP評分選擇的，所以作者隨后考慮了Glide XP評分和MIC值之間的相關性。結果發現，數據并沒有確定Glide XP得分和MIC值之間的相關性。作者推測這可能是由于大多數Hit化合物在MIC檢測中的低溶解度妨礙了對其抗細菌活性的準確評估，以及/或Hit化合物對分枝桿菌細胞的滲透能力較差等原因。

圖2. 化合物G24和G26的化學結構。圖片來源：JCIM

抑制結核分枝桿菌DNA促旋酶ATP酶活性

由于化合物G24和G26對結核分枝桿菌H37Rv和H37Ra菌株的生長有抑制作用，并且在該試驗中比新生霉素更有效。作者隨后以新生霉素作為參照，測定化合物抑制結核分枝桿菌DNA促旋酶ATP酶活性的IC50。結果顯示，G24和G26對ATP酶抑制的IC50分別為2.69和2.46μM（圖3），與新生霉素（IC50 1.27μM）表現出相當的ATP酶抑制活性。由于這兩種化合物在細胞實驗和酶抑制試驗中都具有活性，作者推測它們的抗結核活性可能是由于抑制了DNA促旋酶的ATP酶。因此，G24和G26被認為是可進一步開發新型抗結核藥物的很有前景的先導化合物。

圖3. 抑制結核分枝桿菌DNA促旋酶ATP酶活性。圖片來源：JCIM

抑制劑結合在ATP結合位點

隨后，作者對G24和G26與結核分枝桿菌DNA促旋酶GyrB亞基中ATP結合位點的結合模式進行了分析。這些化合物的化學結構包括等效的5-甲基-2、3-二苯基-1H-吲哚疏水頭部，具有不同的羥乙基/氨基（G24）和羥乙基/哌嗪基（G26）極性尾部（圖2）。由于由Specs數據庫提供的兩種化合物G24和G26的精確立體化學構型尚未被確定，所檢測的化合物可能是外消旋體，因此作者進一步考慮了它們在R和S構型中的結合模式。G24在R和S構型的預測結合模式不同，分子對接計算得到的不同的Glide XP評分(?7.5和?5.7kcal/mol)。而預測結果表明，R構型中的化合物G24可能更有利地結合GyrB ATP結合位點?；衔颎26的R和S構型的預測結合模式則相似，Glide XP評分相當（?6.9和?7.4kcal/mol）。作者在比較化合物G24的R構型和G26的S構型這些更有利的結合模式時，發現兩者預測的結合模型更為相似, 疏水頭部基團很好地重疊。此外Glide XP評分也具有可比性。這些數據表明，G24和G26對GyrB ATP結合位點的結合親和力沒有顯著差異，與IC50測試結果一致。模擬的結構也表明，二者很可能都結合在一個與ATP腺苷基團所利用的結合位點部分重疊的結合位點上。

隨后利用MD進一步分析了化合物G24(R構型)和G26(S構型)與GyrB ATP結合位點的結合?；衔镌?GyrB ATP結合位點的結合模式由分子對接得到，在經過了三個重復MD模擬后，其RMSD值表示與初始對接結構相比，在平衡態上略有不同(G24和G26分別為～1.6?2.5 ?和～1.4?1.7?)。在配合物的MD模擬中觀察到涉及化合物極性尾部的氫鍵（圖4），在分子對接結果中沒有體現。G24的極性尾部與Glu56形成氫鍵，這在三次重復的MD模擬中都可以觀察到，而G26的極性尾部則與Asn52和Arg82形成氫鍵。在三次重復MD模擬中，兩種化合物與GyrB ATP結合位點的平均結合自由能(ΔGPBSA和ΔGGBSA)是相似的。這些結果表明， G24和G26對結核分枝桿菌DNA促旋酶GyrB具有相似的結合親和力，與二者IC50值相似的結果一致。

圖4. 化合物G24和G26在三次重復MD與GyrB ATP結合位點的結合模式。圖片來源：JCIM

藥效團映射分析

用LigandScout 4.4生成的2D藥效團模型來分別表示結核分枝桿菌DNA促旋酶與G24和G26之間的主要相互作用（圖5）。生成的兩個模型識別了三種不同的藥效團特征：(i)化合物頭部基團的疏水特點，使其結合于由Val49、Ala53、Ile84、Val99、Met100、Val125和Val171形成的疏水口袋；（ii）極性尾部帶有正電的部分指向Glu56；（iii）G24和G26的氫鍵供體分別與Glu56和Asn52相互作用，G26的氫鍵受體與Arg82相互作用。分析表明，這兩種化合物的疏水頭部和極性尾部可能對它們抑制結核分枝桿菌DNA促旋酶的ATP酶活性有重要作用。其中，G24和G26的極性尾部，可能通過增強與GyrB ATP酶位點的相互作用和提高溶解度來提高抗結核活性。

圖5. G24和G26的藥效團模型。圖片來源：JCIM

結論

本文介紹了虛擬篩選如何結合生物活性實驗識別新的具有抗結核劑潛力的結核分枝桿菌DNA促旋酶ATP酶抑制劑。篩選得到的化合物G24和G26對結核分枝桿菌菌株表現出比新生霉素更強的抗結核活性，IC50分別為2.69和2.46μM。通過MD模擬發現，這些化合物可以結合到GyrB亞基的ATP結合位點，而藥效團定位分析也進一步表明了疏水、靜電和氫鍵相互作用對結合的重要性。研究為后續抗結核藥物的研發奠定了基礎。

參考文獻

Pakamwong B, Thongdee P, Kamsri B, Phusi N, Kamsri P, Punkvang A, Ketrat S, Saparpakorn P, Hannongbua S, Ariyachaokun K, Suttisintong K, Sureram S, Kittakoop P, Hongmanee P, Santanirand P, Spencer J, Mulholland AJ, Pungpo P. Identification of Potent DNA Gyrase Inhibitors Active against Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 2022 Apr 11;62(7):1680-1690. doi: 10.1021/acs.jcim.1c01390. Epub 2022 Mar 29. PMID: 35347987.