基于從機理上理解復雜的生物相互作用系統的PyBindingCurve技術開發的CLAffinity，可利用藥物篩選過程中常見的蛋白、配體和抑制劑濃度來模擬競爭實驗。
背景介紹
敏感的、并行的和小型化的競爭實驗，通常用于早期藥物發現的初級篩選階段，目的是從中等大小的小分子庫中識別出被命中的化合物。篩選庫中包含的小分子有可能通過競爭占據靶蛋白上相同的結合位點來抑制蛋白-配體相互作用。這些化合物，要么在靶蛋白之前添加到標記的配體溶液中，要么在一定孵育時間后添加到預先形成的復合物中以確保達到平衡。將儀器信號的變化轉換為靶蛋白復合物的配體部分的測量，可以監測由與自由標記配體競爭同一結合位點的抑制劑引起的復合物解離。以這種方式建立競爭實驗，使用標記的配體作為探針，通過該探針可以推斷篩選庫中潛在抑制劑的行為。在規劃篩選試驗時的假設是，通過一個容易與之競爭的弱結合配體可以獲得最大的敏感性。
競爭系統的實際情況常使得這種假設不正確。靶蛋白和標記配體配合物的形成以1:1的化學計量，取決于蛋白質的濃度、相互作用的基本解離常數和標記配體的濃度。增加蛋白濃度，保持標記配體的濃度不變，形成雙曲結合曲線，復合物濃度漸近達到最大值。如果決定在給定的親和力下增加配體結合比例(絡合配體與自由配體)，為了在添加抑制劑時產生更大的讀數變化，可以考慮在保持蛋白濃度不變的情況下增加配體濃度。除了冒著檢測器飽和的風險或進入檢測器的非線性響應范圍外，這種方法還增加了自由未結合配體的數量，比結合配體的數量更多。另外，在保持標記配體常數的同時增加蛋白質濃度也有其自身的缺點；不與配體結合的自由蛋白質的豐度也增加了，而配體是信號的來源，也是復合物形成的功能。與游離蛋白結合的抑制劑，不會導致可檢測的讀數變化，導致檢測靈敏度的降低。這些初步篩選試驗假定結合系統完全平衡。
Huang等人反駁了以上假設，并建議使用親和力最高的配體進行實驗，以確定競爭性抑制劑的親和性。但研究者注意到，這一建議不適用于基于競爭實驗的初級篩選，因為即使是低親和力相互作用也能實現明確的yes/no結合測定。
主要內容
英國愛丁堡大學的Steven Shave & Manfred Auer等人證明，在基于競爭的初級篩選中，使用非常高親和力的配體會降低檢測靈敏度，并最終丟棄潛在的有價值的活性化合物。研究者基于PyBindingCurve軟件技術，開發了CLAffinity工具，它可利用藥物篩選過程中常見的蛋白、配體和抑制劑濃度，來模擬競爭實驗。CLAffinity揭示了基于檢測參數的最佳標記配體親和力范圍，而不是優化檢測靈敏度的一般規則。
開源代碼
https://github.com/stevenshave/competition-label-affinity
也可用pip Python包管理器進行安裝
配體親和力對KD值范圍內抑制劑檢測的影響
制藥公司通常根據標準濃度為10 μM和靶標配體結合度為0.7的標準來篩選化合物。研究者模擬了不同靶蛋白親和力的抑制劑引入時配體結合的分數(儀器讀數)。如圖1所示，x軸表示標記的配體KD值，表示為pKD(?log10(KD))，并從低親和力過渡到高親和力(x軸)。隨著標記配體親和力的增加，達到0.7個配體結合所需的靶蛋白減少。當配體親和力進一步增加，由于難以置換標記的配體，檢測響應的動態范圍被降低。初級高通量篩選，通常旨在識別具有良好檢測敏感性的低微摩爾至中納米摩爾KD值抑制劑，該信號用于產生明確的 yes/no決定，通過定義距離陰性對照均值三個標準差的檢測閾值。這突出了用于進一步確證二次測定和KD值測定的化合物。因此，初級篩選的目標應該是使用能夠產生最大響應的配體，通過大幅降低一系列抑制劑KD值的配體結合比例來實現。
圖1. 在競爭實驗中，配體親和力影響了KD值范圍內抑制劑的檢測。圖片來自JCIM
對于圖1所描述的系統，在一個范圍內抑制劑KD值的信號變化最大的配體pKD為6.975 (105 nM KD)。
為了說明在初次篩選中選擇具有最佳KD值的配體的影響，研究者考慮兩種情況，首先使用一種與靶蛋白的KD值為100 nM的中等至高親和力的配體，另一種與靶蛋白的KD值為1 nM的非常高親和力的配體。在兩個實驗中，將標記配體的濃度保持在10 nM，使用標準庫化合物篩選濃度為10 μM。通過實驗讀數檢測和推斷添加的抑制劑的靶蛋白KD親和力值為1 μM。實驗得到了以下結果：(i)使用KD親和力值為100 nM的標記配體，在沒有抑制劑的情況下，需要240 nM的蛋白才能得到0.7個配體。添加抑制劑后，配合物中配體分數為0.181，讀數降低了74.1%。(ii)使用KD親和力值為1 nM的標記配體，在沒有抑制劑的情況下，需要9.3 nM的蛋白才能得到0.7個配體。添加抑制劑后，配體結合度為0.348，讀數降低了50.3%。
配體結合靶分數越低，說明不同靶親和力的配體所引起的信號降低差異越大。為了證明這一點，研究者考慮了另外兩個實驗，與上述實驗相同，但使用的是靶分數配體，在沒有抑制劑為0.1而不是0.7的情況下結合。在抑制劑存在的情況下，100 nM KD值的中-高親和力配體和1 nM KD值的高親和力配體分別能產生0.011和0.051個分數的配體結合反應。這相當于每次試驗讀出的動態范圍的89.2%和48.5%。當錯誤地應用Huang的建議(在基于競爭的初步篩選中使用可能的最高親和力標記配體)時，進一步增加了將抑制劑誤判為非結合的可能性。
競爭實驗的另一種可視化
圖2是圖1中數據的另一種表示，在x軸上交換配體pKD以獲得抑制劑pKD。這需要對一系列抑制劑親和值的信號還原一目了然，對于實際的分析讀數可視化和理解預期反應更直觀。在圖2中，可以看到，對于弱結合100 μM KD值的配體(上實線，沒有標記)，在所有抑制劑KD值上，幾乎不會破壞0.7個分數配體結合的小信號縮減。顯然，這在使用標準濃度的競爭分析中是沒有用的。當使用KD值為10 μM的配體(帶+的線)時，開始看到對靶標的響應增加。研究發現，在抑制KD值范圍內，信號顯著降低。從100 nM KD的值來看，增加配體親和力只會使響應曲線右移，降低低親和力抑制劑的讀數變化。100 nM配體KD值極限表示了圖1中響應谷的右側出現的特征上升。
圖2. 競爭實驗的另一種可視化，顯示了在配體KD值范圍內，抑制劑pKD與配體結合的分數。圖片來自JCIM
通過模擬，研究者已經證明了次優配體親和力在基于競爭的初級篩選中可能產生的影響，即檢測靈敏度降低和命中次數減少。在這里，不同親和力的抑制劑之間的最大分離是必需的。圖1所示的幾乎是二元響應，使用100 nM KD值的配體(pKD為7)時，很難區分1、10和100 nM抑制劑親和力，因為在所有情況下，分數配體結合幾乎為零。
此外，圖1可以用來直觀地理解Huang關于KD測定的二次測定的建議。低親和力配體抑制劑KDs的分離效果較差。配體的親和性越高，不同KDs的抑制劑的可鑒別性就越高，在圖的右上傾斜一側，抑制劑之間存在較大的分離，表明引入抑制劑后，配體結合部分的變化較小。
總結
本文概述的模擬技術的應用有助于創建更高效的初級篩選及檢測難藥靶標的低親和力抑制劑。為提高敏感性而采取的任何措施，都有助于擴大靶標抑制劑的化學多樣性，從而可能進一步轉化為新的線索。CLAffinity工具的應用，將防止Huang的規則不恰當應用，Huang規則的目的是用于二次確證檢測，而不是初篩。研究者證明，選擇高親和力的配體，可以導致在不必要的高檢測限下排斥有信號的化合物。這種對競爭系統的透徹理解，允許對分析進行調整或適配，使其進入高靈敏度的初級篩選階段。
參考文獻
Steven Shave, Nhan T. Pham, and Manfred Auer. CLAffinity: A Software Tool for Identification of Optimum Ligand Affinity for Competition-Based Primary Screens J. Chem. Inf. Model. Article ASAP DOI: 10.1021/acs.jcim.2c00285