詳解Fc工程通過調節抗體功能來賦予藥物更強腫瘤殺傷能力和免疫激活能力的四種方式
抗體的可結晶片段(Fc)結構域與大量的細胞Fc受體(FcRs)或可溶性蛋白之間的相互作用形成了體液免疫和先天免疫之間的關鍵聯系。尤其免疫球蛋白G Fc結構域對于通過以下方式來清除靶細胞的過程至關重要，(a)細胞毒性、吞噬或補體溶解；(b)調節炎癥；(c)抗原呈遞；(d)抗體介導的受體聚集；(e)細胞因子的釋放。超過30個旨在調節這些過程以獲得最佳治療效果的抗體正在臨床評估中或已經獲得批準。
得克薩斯大學奧斯汀分校的George Georgiou課題組于今年4月發表在國際頂級期刊Annual Review of Biomedical Engineering（該期刊在生物醫學工程科學領域中77種刊物中排名第1，每年僅出版一期，5年影響因子14.615）的綜述用四個章節詳細介紹了Fc相關的進展。
前兩章介紹了經典Fc受體（FcR）的種類，并分述各類Fc受體表達結合情況及其功能等。隨后對FcR的信號特異性、相關信號通路以及功能的研究進行了介紹。一般來說，與Fc受體相關的效應功能有以下幾個：
1. 抗體依賴的細胞介導的細胞毒性（ADCC）(FcγR介導) 或補體依賴的細胞介導的細胞毒性(CDCC)（補體介導），該過程涉及到自然殺傷（NK）細胞和中性粒細胞；
2. 靶點吞噬和內溶酶體破壞，包括抗體依賴的細胞介導的吞噬(ADCP）和補體依賴的細胞介導的吞噬(CDCP)；
3. 補體依賴的細胞毒性(CDC)。由病毒靶細胞表面的膜攻擊復合(MAC)的形成介導，導致其裂解；
5. 激動性的Fc介導的細胞表面受體聚集觸發激活或凋亡信號；
6. 適應性免疫反應，通過抗原呈遞、B細胞活化和誘導耐受性來調節。
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圖1 抗體效應功能總結。圖片來源：Annu. Rev. Biomed. Eng.
第三章對Fc結構域的分子結構以及其在FcR結合中的作用進行分享。最后一章介紹了如何通過Fc工程來調節抗體功能。本文將對如何通過Fc工程這項賦予抗體藥物更強的腫瘤殺傷能力和免疫激活能力的技術來調節抗體功能的部分進行詳細的介紹。
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圖2 IgG1 Fc和Fc結合受體的結構。圖片來源：Annu. Rev. Biomed. Eng.
早期研究中，Fc：FcγR相互作用的結構信息是被用來參與激活FcγRs結合增強的突變體的。最近，研究者們開始對抗體的Fc部分進行改造，通過突變某些氨基酸殘基來改變Fc的親和力，以生成藥效更好、毒性更小的抗體，這也是目前最為常用的Fc改造方式。文章將代表性的Fc改造案例進行了詳細的描述，并將案例的關鍵性突變總結于表1。
表1 改變治療抗體Fc結構域以調節效應FcR功能的例子。來源：Annu.Rev. Biomed. Eng.? ??
補體是抗體對病原體和病毒發揮細胞毒性的另一個主要途徑。補體級聯（complement cascade）在腫瘤清除中的作用因腫瘤類型而異，補體抑制劑的存在、抗原密度甚至抗原表位都是調節補體依賴性細胞殺傷的關鍵因素。補體通路與FcγR效應通路在腫瘤根除中的相對貢獻尚不清楚。文中總結，在CH2較低結構域引入K322A突變可大大降低與C1q和CDC的結合，而對FcγR的結合僅略有影響；補體激活足以介導FcγR-/-小鼠(缺乏所有激活受體)中CD20+白血病細胞的消耗，C3b沉積有助于細胞介導的殺傷(CDCC和/或CDCP)；使用不與FcγRs結合的工程去糖基化Fc，C1q單獨結合可誘導補體驅動的細胞毒性和吞噬作用，并抑制裸鼠CD20+細胞的腫瘤生長。除了六聚化突變外，通過突變Fc (S267E、H268F和S324T)增加對C1q的親和力會導致細胞毒性和補體效應因子增加。重要的是，這些突變可以與FcγR增強的修飾結合，以最大限度地提高細胞毒性。
增加單克隆抗體在體內循環中的持久性可降低劑量需求并增提高藥物的生物利用度。增加對FcRn親和力的Fc突變不一定會增加循環中抗體半衰期。相反，保留與FcRn的pH敏感結合對于更有效的內吞體循環，和延長抗體的半衰期至關重要。許多具有增強藥代動力學的Fc變異已被發現，突變體M252Y/S254T/T256E和M428L/N434S（Xtend?；見表1中ravulizumab）被證明可以使人類抗體半衰期增加兩倍以上。
靜脈注射免疫球蛋白(IVIg)被用于治療大量的自身免疫性和過度炎癥綜合征。高劑量的IVIg(通常>1 g/kg)與內源性IgG競爭FcRn介導的再循環，從而顯著降低血清中自身抗體的持久性。設計的在pH 6.0和7.4時增強FcRn親和力的Fc結構域已被證明能干擾IgG抗體的再循環，從而顯著降低循環中致病性自身抗體水平，并在多種自身免疫性疾?。òㄖ匕Y肌無力、血小板減少等）中顯示出治療效果（見表1）。
IVIg可以發揮獨立于FcRn的直接抗炎作用。據報道，唾液酸化IVIg在較低劑量下更有效。雖然末端唾液酸化對FcγRs的親和力有輕微影響，但唾液酸的作用主要歸因于與II型FcRs的結合。盡管這些受體介導抗炎作用的確切機制仍存在爭議，目前正進行II期臨床試驗，用于ITP和慢性炎性脫髓鞘性多性神經病變(見表1中的M254)。
可溶性的、多聚的Fcs能夠阻斷FcγR驅動的炎癥反應。Ortiz等人研究指出，Fc三聚體能阻斷FcγR參與而不導致其激活，并且在臨床前關節炎和ITP小鼠模型中優于IVIg(見表1中CSL730)。
增強與FcγRIIb結合的Fc設計方法也被用作自身免疫或過敏干預。在抗CD19或抗IgE Fab中進行S267E/L328F雙突變，可使得FcγRIIb(和FcγRIIaR131)的親和力增加430倍，阻斷Ca2+流動，促進B細胞凋亡。但FcγRIIb親和力增強的抗體可被表達高水平FcγRIIb的LSECs迅速從循環中清除，因此該方法常被用來構建可快速清除循環中的靶分子的清除抗體。清除抗體GYM329可以抑制并介導肌肉生長抑制素的清除，正處于臨床開發階段。
Fc工程已成功地用于與典型的FcγRs、FcRn和C1q之外的受體結合。在最近一項研究中，Kariolis等人報道了IgG CH3結構域側表面轉鐵蛋白受體結合位點的設計，且不影響pH依賴的FcRn結合。在食蟹猴模型中，轉鐵蛋白受體結合導致可通過血腦屏障的抗體顯著增加。另外，通過融合IgG和IgA Fc結構域，Kelton等人也創建了一種交叉同型抗體(稱為IgGA)，能與人激活的FcγRs和C1q以及FcαRI結合。
在過去的30年里，隨著對FcRs生物學的理解的進步，利用結構突變、隨機突變，篩選等方法進行IgG Fc結構域的蛋白工程以篩選達到與治療相關受體之間的理想結合譜，以及使用人源化小鼠模型和其他新工具來評估Fc效應功能，為設計一系列重要的抗體治療藥物開辟了道路。Fc設計被證明對于更好地理解髓系細胞上表達的每個效應FcRs所介導的細微差異和表型效應非常有用。
當結合不同的突變組時，需要仔細設計，因為盡管在Fc上的Fcγ和FcRn結合位點之間存在距離，但這兩個結構域之間有可能存在變構調控。這種效應已在攜帶 FcRn 增強突變的 Fc 的 FcγR 結合減少中得到證實。將Fc工程與效應功能的高通量監測相結合，可以闡明這種微妙的影響，并可能有助于揭示新的療法。
Fc工程涉及到抗體序列和結構，這些特征也是抗體文庫構建、體外親和力成熟等其他抗體工程學改造的基礎，而正確對Fc的氨基酸位點進行編號，是分析已有的Fc工程技術以及設計Fc工程化突變的前提，但很多抗體從業人員也不知道如何對Fc進行Eu編號。
WeSeq支持幾乎所有主流的編號規則， 例如：可變區廣泛使用的Kabat、Chothia 和 IMGT，以及恒定區主要使用的Eu規則。以Margetuximab為例，在WeSeq中選擇菜單中的Numbering->EU，即可對Fc進行編號。導入IgG1序列進行比對，align之后利用toggle功能將Margetuximab的保守殘基用“*”號顯示，發現WeSeq成功識別了前文表1中的五個突變位點：L235V、F243L、R292P、Y300L、P396L。?
橘色線條為EU系統標注的Fc域，色塊則為Kabat系統標示的CDR區,紅框為突變位點
除了WeSeq，WeMol還有一個專有的計算模塊Antibody Numbering也可滿足抗體Fc編號的需求，同樣的以Margetuximab為例，在Antibody Numbering模塊界面，切換到Constant Region (Fc）面板，上傳帶Fc的抗體序列（Fasta格式），點擊提交：
計算模塊提交任務界面
Fasta格式的Margetuximab序列如下。兩條鏈的名字可以是任意的，WeMol會自動識別可變區和輕重鏈。
>Margetuximab.H
QVQLQQSGPELVKPGASLKLSCTASGFNIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIYPTNGYTRYDPKFQDKATITADTSSNTAYLQVSRLTSEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGASVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELVGGPSVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTLRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>Margetuximab.L
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVNTAVAWYQQKPGHSPKLLIYSASFRYTGVPDRFTGSRSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYTTPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
結果文件會顯示Fc部分每個殘基的位置編號和Eu編號，以及所屬結構域（CH1/Hinge/CH2/CH3）。
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Delidakis G, Kim JE, George K, Georgiou G. Improving Antibody Therapeutics byManipulating the Fc Domain: Immunological and Structural Considerations. Annu Rev Biomed Eng. 2022 Jun 6;24:249-274.
doi: 10.1146/annurev-bioeng-082721-024500. Epub 2022 Apr 1. PMID: 35363537.
