引言
通常用于治療新疾?。ɡ鏑OVID-19）的藥物重定向通常始于對現有藥物進行虛擬篩選，然后進行實驗驗證，但是使用傳統的計算方法，實際命中率通常較低。來自中山大學藥學院的羅海彬教授研究團隊自主發展的基于加速的自由能微擾-絕對結合自由能計算（FEP-ABFE）的虛擬篩選方法可以達到空前的高命中率，在一周內完成對老藥數據庫的高效篩選，并成功鑒定出15種有效的SARS-CoV-2主要蛋白酶（Mpro）抑制劑，Ki為0.04-3.3μM，特別是抑制活性最好的藥物雙嘧達莫（dipyridamole）表現出對新冠肺炎較好的臨床治療效果，進一步證明了基于FEP-ABFE的虛擬篩選方法的巨大潛力和可靠性。
背景
由嚴重急性呼吸系統綜合癥冠狀病毒2（SARS-CoV-2，也稱為2019-nCoV）引起的持續的COVID-19大流行已成為全球性危機，最快而有效的方法是將已有的藥物重新用于治療COVID-19。鑒于Mpro在病毒生命周期中的基本功能及其高度的保守性，SARS-CoV-2 Mpro是治療COVID-19的天然靶標。因此，人們一直在努力嘗試使用各種基于藥效基團、分子對接和分子模擬的虛擬篩選方法來靶向Mpro的治療候選藥物。但是，使用傳統的計算方法進行虛擬篩選的實際命中率一直很低，計算預測的絕大多數的候選分子一般都是假陽性，主要原因之一是因為很難可靠地預測蛋白質-配體分子結合自由能。虛擬篩選的命中率往往取決于虛擬篩選過程中使用的受體-配體結合自由能預測的可靠性和準確性。因此，虛擬篩選工作成功的關鍵是使用可靠的計算方法來準確預測結合自由能。
加速自由能微擾-絕對結合自由能計算新方法（GA-FEP）
分子間相互作用的自由能擾動（FEP）模擬被認為是一種可靠的方法，能夠達到較好的自由能計算精度，但是傳統的FEP方法一般僅限于模擬配體的一些細微結構變化以進行相對結合自由能（RBFE）計算。RBFE計算可用于指導有潛力的先導化合物的優化，但不適用于虛擬篩選完全不同的分子結構以識別得到新的靶標藥物。與傳統的計算方法（例如藥效團，分子對接和分子模擬）相比，FEP-ABFE方法的優勢在于可以更準確地預測配體與其靶標之間的結合親和力。但是，先前使用的FEP-ABFE計算非常昂貴且耗時，因此不適合用于虛擬篩選（篩選大量化合物所需的篩選目的）。為了使FEP-ABFE方法對于虛擬篩選切實可行，羅海彬教授團隊提出了能準確描述FEP熱力學循環中添加束縛步驟ΔU概率分布公式，并將其命名為RED函數。通常FEP約束能量需要12個λ窗口才能夠準確計算，而經RED函數分析和擬合后，該方法使用一步微擾（2個λ窗口）即可準確計算約束能量。RED函數極大加速了FEP-ABFE的預測計算速度，使得GA-FEP方法首次能應用于新藥的虛擬篩選研究中。
基于GA-FEP的虛擬篩選及實驗驗證
為了鑒定有效的SARS-CoV-2 Mpro抑制劑，研究團隊首先對所有現有藥物數據庫進行了基于FEP-ABFE的虛擬篩選，然后進行了體外活性測定，如圖1所示。
圖1?基于FEP-ABFE針對SARS-CoV-2 Mpro的藥物重新篩選
圖片源自PNAS.
具體而言，將所有現有藥物對接到SARS-CoV-2 Mpro的結合位點后，對六個主要殘基Cys145，His41，Ser144，His163，Gly143，Gln166和Gln166進行了進一步的FEP-ABFE計算。最終選擇了25種藥物用于隨后的體外實驗活性測試。根據體外結果，這25種藥物中有16種顯示出相當大的抑制SARS-CoV-2 Mpro的潛力，如圖2所示。值得一提的是，這些藥物與靶標的理論親合力與實驗親合力差值絕大多數均小于2 kcal/mol，而常用的MM-PBSA和GBSA兩種方法得到的差值均大于10 kcal/mol，結果如表1所示。因此，對于蛋白-配體結合自由能預測，FEP-ABFE方法確實比傳統的MM-PBSA和MM-GBSA方法都更加準確。
在這16種化合物中,抑制活性最高的化合物為由本方法首次發現的雙嘧達莫（Dipyridamole），Ki為40 nM，EC50?為100 nM。該藥物已經在后續的臨床實驗上證實了其對新冠肺炎有較好的治療效果。
圖2 確認的16種SARS-CoV-2 Mpro抑制劑的分子結構和Ki值
圖片源自PNAS.
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圖3 實驗確認的SARS-CoV-2 Mpro抑制劑的FEP-ABFE，MM-PBSA和MM-GBSA結合自由能計算結果
圖片源自PNAS.
總結
總而言之，本文通過將加速的FEP-ABFE預測用于靶向SARS-CoV-2 Mpro的藥物再利用，然后進行實驗驗證，從現有藥物中成功鑒定出總共16種有效的SARS-CoV-2 Mpro抑制劑，其中最有效的是雙嘧達莫（Dipyridamole）（Ki = 0.04 μM），目前正在臨床研究當中。篩選結果表明通過加速的FEP-ABFE預測方法進行的虛擬篩選已顯示出極好的準確性，在Ki = 4μM的閾值下，命中率高達60％?；贔EP-ABFE預測的虛擬篩選方法將在許多其他藥物重新利用或發現新的藥物工作中將十分有用。
參考文獻
Identify potent SARS-CoV-2 main protease inhibitors via accelerated free energy perturbation-based virtual screening of existing drugs.Zhe Li, Xin Li, Yi-You Huang, Yaoxing Wu, Runduo Liu, Lingli Zhou, Yuxi Lin, Deyan Wu, Lei Zhang, Hao Liu, Ximing Xu, Kunqian Yu, Yuxia Zhang, Jun Cui,Chang-Guo Zhan, Xin Wang, and Hai-Bin Luo. PNAS 2020; https://doi.org/10.1073/pnas.2010470117