通過分子對接、虛擬篩選、MD結合生物活性實驗，中科院上藥所柳紅團隊獲得了GLP-1R的亞微摩爾級別的正變構調節劑，為設計B類GPCR的小分子藥物開辟了新的途徑。
背景介紹
胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)是分泌素樣B類G蛋白偶聯受體(GPCR)的一員，是治療II型糖尿病的主要靶點。GLP-1R被腸促胰島素肽GLP-1激活后表現出廣泛的生理效應，包括葡萄糖依賴的胰島素分泌和生物合成、抑制胰高血糖素釋放、胰腺β細胞存活、改善胰島素敏感性和延遲胃排空。
目前發現的作為GLP-1R激動劑的小分子，包括Boc5、RGT1383、TTP273(vTv Therapeutics/華東醫藥)、PF-06882961（輝瑞）和LY3502970(Chugai/Eli Lily)，其中TTP273、PF-06882961和LY3502970已經進入了臨床階段。雖然最近在GLP-1R結構生物學上取得了突破，但已經揭示了一些臨床候選分子的結合位點及其相近的類似物都在螺旋束中占據相似的結合位點，部分與GLP-1的原位點重疊。RGT1383作為GLP-1R的全激動劑，幾乎與GLP-1的10?20殘基占據的位置完全重疊。
除激動劑的開發外，GLP-1R正變構調節劑(PAMs)的發現可以增強天然肽的親和力和功效，這是一種很有前景的策略，變構調節劑能夠提供更好的受體亞型選擇性和藥物安全性。在沒有正構配體的情況下，PAMs不發揮任何藥理作用，并顯示出配體依賴的信號偏倚，可以精細控制受體功能和減少副作用。最近報道的幾種GLP-1R變構調節劑大多存在未知的結合位點和不利的物理化學性質，如效力弱、固有親電性和高分子量，這些都阻礙了這些先導化合物的進一步開發。
在本研究中，通過靶向假定的隱變構位點，作者發現了GLP-1R新的PAMs，如L7（1）。通過進一步優化得到了PAM L7-028（2），其通過亞微摩爾級的生物活性增強了GLP-1的結合親和力和cAMP信號通路。分子動力學模擬和定點突變解釋了L7-028誘導正變構的機制。針對GLP-1R模擬模型的變構位點，作者發現了具有不同化學型的新的PAMs C5（3）和C16（4）。并進一步研究了這些PAMs引起的GLP-1R的下游信號譜，這可能為針對B類GPCRs的治療提供有價值的信息。
GLP-1R PAMs的發現
GLP-1R PAMs的發現是通過高通量篩選得到的。作者基于CRF1R的結構(PDB：4K5Y) 構建了具有深跨膜口袋的人GLP-1R同源模型(圖1a)，并對該口袋利用分子對接篩選了Specs數據庫中的20多萬種商業化合物。最終選擇了24種結構多樣的類藥化合物進行生物測定。
作者發現化合物L7（1）(圖1B)能夠增加高濃度下GLP-1的結合親和力和cAMP的積累，并對L7的兩個結構域進行了SAR分析，以確定可能提高GLP-1R活性的結構變化。隨后作者設計并合成了一系列新的苯并酰胺作為化合物L7的類似物。通過結構優化發現了L7-028。該化合物增加了與I-GLP-1的結合親和力，EC50為11.01±2.73μM，并將競爭性放射性配體結合試驗中與GLP-1的結合親和力從7.6nM提高到2.9nM(圖1C)，還增強了GLP-1誘導的cAMP信號通路(圖1D)。L7-028并沒有促進配體誘導的CRF1R的激活，這表明其對GLP-1R具有選擇性。
圖1. GLP-1R PAMs 的Hit-to-lead優化。?圖片來源：ACS Chem. Bio.
PAM結合口袋的表征
在虛擬篩選模型中，PAM結合口袋由跨膜螺旋TM3、TM5和TM6的一半組成，包含6個疏水殘基和2個極性殘基(圖2A)。對接研究中，L7-028的對接打分為–10.3 kcal mol?1，表明其具有較高的結合親和力。為識別關鍵殘基，作者采用基于殘基的能量分析來分解對接模型的配體結合能。結果表明，5個受體殘基(Tyr2413.44b、Ile3175.47b、Phe3245.54b、Ile3576.46b和Leu3606.49b)表現出較低的范德爾能量分數（rosetta能量單位小于?2.0），表明它們可能是L7-028結合的主要貢獻者，結合模式見圖2B?D。
為了驗證對接模型，作者將以上5個關鍵殘基分別突變為丙氨酸，并在放射性配體結合試驗中與野生型(WT)受體進行了比較(圖2E)。Y241A、I317A和F324A的單點突變將L7-028對GLP-1的增強效應向右偏移。L357A和L360A突變體消除了PAM增強GLP-1結合的能力。實驗結果與對接模型一致。
圖2. L7-028在GLP-1R結合口袋上的特性。圖片來源：ACS Chem. Bio.
MD揭示變構體作用的機理
在分子對接研究的基礎上，作者建立了GLP-1R和L7-028的復合物模型。將該模型置于顯式膜環境中建立復合物模擬系統。為了評估PAM的影響，作者又從復合物模型中移除L7-028，構建了apo GLP-1R系統。除此之外，作者還建立了一個GLP-1R/GLP-1/L7-028復合物模擬系統。每個系統都被獨立重復模擬三次。
在GLP-1R/L7-028模擬中，與起始構象相比，L7-028向GLP-1結合袋的底部移動，并與跨膜螺旋TM7相互作用。除了對接模型中顯示的配體結合殘基外，MD模擬顯示TM7殘基Gln3947.49b與L7-028在72.2%的模擬軌跡中相互作用(圖3A，B)。因為Gln3947.49b位于GLP-1結合口袋正下方，作者假設該殘基在PAM增強的GLP-1結合中發揮了重要作用。隨后作者設計了Q394A單點突變以證明假設。在放射性配體結合試驗中，與WT相比，L7-028對突變體受體的正調節作用顯著降低(圖3C)，與MD模擬結果一致。雖然在模擬中，L7-028向GLP-1結合袋移動，但在GLP-1R/GLP-1/L7-028系統中，PAM和GLP-1之間的平均最小距離為8.8±1.3?，表明L7-028可能通過變構調節而不是與肽的直接相互作用來增強GLP與GLP-1R的結合。
在apo GLP-1R模擬中，TM3殘基Tyr2413.44b與TM6殘基Leu3606.49b之間的平均最小距離為4.0±0.6?，表明這兩個殘基之間有穩定的相互作用(圖3D)。此外，也可以觀察到TM5殘基Phe3215.51b和TM6殘基Ile3576.46b之間的疏水相互作用，平均最小距離為4.0±0.4?(圖3D)。然而，這些相互作用因為L7-028的插入被破壞(圖3E)。在GLP-1R/L7-028系統中，GLP-1結合位點與TM6之間的平均Cα原子距離為12.6±0.5?，比apo系統長約2.5?(10.1±0.5?)(圖3E)。在GLP-1R/L7-028系統中，TM3和TM5之間的平均距離大約比apo系統長3.0?。L7-028使TM6螺旋遠離GLP-1結合位點附近的跨膜螺旋TM3和TM5。GLP-1R/L7-028系統的螺旋間距離增加，GLP-1結合口袋增大 (圖3G)，GLP-1R/L7-028系統中GLP-1結合袋的平均溶劑可及表面積也大于apo系統。
MD模擬表明，L7-028可能會增加TM6螺旋與其他跨膜螺旋之間的距離，從而打開GLP-1結合袋以促進配體識別。為了驗證這一假設，作者設計了G361F突變來模擬PAM的作用，該突變可能會破壞TM6螺旋與其他螺旋，包括TM3和TM5之間的密切相互作用，從而打開GLP-1結合袋。在放射性配體結合實驗中，G361F突變體對GLP-1的親和力(IC50=2.13±0.62nM)高于WT(IC50=14.38±3.75nM)，支持了作者的假設(圖3F)。
PAM結合位點由跨膜殘基Tyr2413.44b、Ile3175.47b、Phe3245.54b、Ile3576.46b、Leu3606.49b和Gln3947.49b組成。分泌素樣B類GPCRs中TM3?TM6界面的保守疏水殘基Tyr2413.44b(或Phe3.44b)和Leu3606.49b(或Phe6.49b)可以與Ile3175.47b、Phe3245.54b和Ile3576.46b產生穩定的疏水相互作用，從而產生靠近GLP-1結合位點的TM3、TM5和TM6的緊密構象。同樣，用一個大的側鏈殘基（苯丙氨酸）取代Gly3616.50b能夠模擬PAM結合的效果，這有效地增加了GLP-1的親和力。這一結果也與之前的研究一致，即I317C和G361C之間的二硫鍵限制了TM3、TM5和TM6的運動，從而鎖定受體的非活性構象并消除配體結合。?
圖3. ?MD模擬顯示L7-028對GLP-1結合的正變構效應。圖片來源：ACS Chem. Bio.
MD指導下的新PAMs的發現
根據上述分子機制，作者進一步利用MD模型來發現新的先導化合物。對從Specs數據庫中篩選出的商業化合物與模擬的跨膜口袋進行了篩選(圖4A)。作者只選擇了與Y2413.44b、I3175.47b、F3245.54b、I3576.46b、L3606.49b和Q3947.49b相互作用的化合物，按此標準最終選擇了20種結構多樣的類藥化合物來進行生物測定。研究發現，化合物C5和C16(圖4B)顯著提高了GLP-1的結合親和力(圖4C)。C5的EC50值為1.59±0.53μM，C16的值為8.43±3.82μM，均優于L7-028(EC50=11.01±2.73μM)。模擬配體結合袋中殘基的替代減少或消除了C5和C16的正調節作用(圖4D，E)，表明它們與模擬跨膜袋結合。
圖 4. 基于MD模型的新PAMs的發現。圖片來源：ACS Chem. Bio.
PAMs的信號
作者表征了L7-028、C5和C16在不同配體存在下的信號傳導譜，包括多個臨床使用的多肽。在cAMP積累試驗中，三種化合物的GLP-1響應曲線左移程度相似(圖5A和表1)。當阿必魯肽存在時，C5比L7-028和C16增強其反應效果更好(圖5B和表1)。然而，這三種PAMs對其他肽激動劑誘導的cAMP反應沒有顯著影響，表明存在探針選擇性變構作用。
另一方面，L7-028、C5和C16對GLP-1誘導的β抑制素1/2招募有顯著影響(圖5C)。特別是，C5顯著增強了GLP-1在該參數上的效價。這些結果表明，這三種PAM表現出不同的信號分布。C5增強的GLP-1刺激的β-抑制素1/2的招募要比增強的cAMP的積累更多。在其他肽激動劑中也觀察到類似的信號調節。
針對所提出的PAM結合位點，作者發現了基于不同化學型的不同通路譜的小分子配體。它們的特性提供了新的骨架信息和一個可以合理設計具有GLP-1R信號偏倚的PAM框架。在一些T2DM患者中發現了低GLP-1水平，對治療的響應有所降低，且β-抑制素1/2與GLP-1R介導的胰島素分泌有關。因此，這里發現的PAMs可能為這種致命疾病提供一種新的治療策略。
圖5. ?L7-028， C5和C16的信號。圖片來源：ACS Chem. Bio.
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表1 PAMs對cAMP積累和β-抑制素招募的影響。表格來源：ACS Chem. Bio.
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結論
作者通過虛擬篩選，MD和生物實驗鑒定了多個具有不同化學骨架的GLP-1R PAMs，它們能夠結合到一個隱蔽的變構位點。雖然作者的研究尚未得到具有較強活性的PAMs，但大量的優化和對具有更大化學多樣性化合物的虛擬篩選將有助于提高靶向該位點的分子效力和藥代動力學特性?；衔顲5為GLP-1R新調節劑的開發提供了有用的信息。
參考文獻
Wang J, Yang D, Cheng X, Yang L, Wang Z, Dai A, Cai X, Zhang C, Yuliantie E, Liu Q, Jiang H, Liu H, Wang MW, Yang H. Allosteric Modulators Enhancing GLP-1 Binding to GLP-1R via a Transmembrane Site. ACS Chem Biol. 2021 Nov 19;16(11):2444-2452. doi: 10.1021/acschembio.1c00552. Epub 2021 Sep 27. PMID: 34570476.