使用氫-氘交換質譜(HDX-MS)結合計算建模，提供了一種新穎的方法來可視化降解誘導的三元復合物，體現了理性降解劑設計的思想，是第一個利用溶液數據的模型。
背景介紹
靶向蛋白降解(TPD)領域在過去的十年中呈指數增長，其目標是開發利用泛素-蛋白酶體系統標記蛋白質的破壞療法。實現TPD的一種常見方法是使用一種異雙功能分子，稱為降解劑，將感興趣的蛋白靶標招募到E3連接酶機制中促進泛素化，隨后由蛋白酶降解。降解劑表現為連接酶激活劑，且不一定需要調節靶蛋白活性，這擴大了可調節蛋白的范圍，有利于靶向一些難藥靶點。
中間三元復合物(靶蛋白-降解劑-連接酶)的生成在降解過程中至關重要。理解三元復合物幾何結構為選擇性、催化效率、連接劑化學和合理的降解劑設計提供了有價值的見解。深入了解靶標相對于連接酶的定位，對合理的降解劑設計具有潛在的價值。
BRD4是一個有前景的腫瘤治療靶點，且已有公司對BRD4的降解物進行了成藥性研究?；衔顲FT-1297是一種BRD4降解劑，具有強大的生物化學特性、極高效的體外降解能力和良好的藥代動力學特性。
本研究中，作者利用HDX-MS識別降解誘導的蛋白-蛋白界面。HDX-MS是研究蛋白質構象動力學的一種強有力的技術。實驗在溶液中進行以避免晶體接觸。HDX-MS數據雖然信息豐富，但缺乏晶體結構的分辨率。因此，計算技術與HDX-MS衍生約束的結合對提高模型的實用性有潛在的協同作用。作者隨后利用這些數據結合約束蛋白對接建立三元復合體的三維模型，進行進一步的分析。這是第一個利用溶液數據的模型，并提供了一種新穎的方法來可視化降解誘導的三元復合物以支持合理的降解劑設計。
CFT-1297促進BRD4-CRBN復合物形成
使BRD4在HEK 293T細胞中降解
首先，作者用實驗證明了CFT-1297分別對BRD4和CRBN的結合，在一定濃度下可以促進三元復合物的形成，且相比于二元復合物，在CFT-1297存在時更傾向于形成三元復合物（Kternarytf?= 4 nM vs Kbinaryd = 58 nM, 圖1B,D）。實驗數據表明CFT-1297具有較高的協同性（α=21）。另外，作者測試了CFT-1297在HRK293T細胞中降解全長BRD4的能力（圖1E）。3h時，BRD4顯著降解，DC50值為5 nM，蛋白水平降低至Emax為3%。這些數據突出了CFT-1297作為有力的候選化合物在三元復合物中連接BRD4與E3連接酶CRBN的能力。
另一個分析的降解劑為dBET6小分子，與CFT-1297具有相似的化學骨架。雖然同為BRD4降解劑，但與CFT-1297不同，dBET6在三元復合物中展現出較大的中立的蛋白-蛋白相互作用及較小的協同性（α=2）（圖1D）。dBET6在3h時，于HEK293T中降解BRD4的DC50值為6 nM，Emax為3%（圖1E），與CFT-1297相似。此外，之前報道的dBET6的負協同性與晶體結構所暗示的有利結合模式的觀點相反。這些差異促使了對dBET6和CFT-1297的三元復合物形成的進一步分析。
圖1.. 化合物的特點及HDX方法流程。圖片來源：ACS Chem. Bio.
CFT-1297在二元復合物中誘導BRD4（BD1）結構域溶劑屏蔽
使用HDX-MS來識別降解誘導蛋白-蛋白界面，其方法是檢測復合物形成時屏蔽靶蛋白和連接酶的差異。在三元復合物形成之前，異雙功能降解劑可以分別與每一種蛋白質接觸。這種二元相互作用可導致在蛋白的結合位點發生屏蔽事件。
作者的HDX-MS實驗遵循了一個嚴格的分析順序:(1)連接酶和目標蛋白與二甲基亞砜(DMSO)，(2)每個蛋白分別與感興趣的降解劑，(3)包括連接酶、目標蛋白和異雙功能降解分子的三元復合物(圖1F,G)。使用這種方法可以評估蛋白質本身的動力學，了解由于降解物造成的屏蔽，然后確定哪些區域在這三種成分的存在下被屏蔽。
作者發現，在HDX-MS實驗條件下，CFT-1297在BRD4的BD1結構域中誘導了溶劑屏蔽 (圖2A，B)。在30分鐘時，化合物結合引起的屏蔽與DMSO對照的分離最為顯著。多肽的相對分數差異高達35%，相對攝取量為3.5Da差異。具有代表性的攝取圖顯示了具有顯著保護作用的肽段(圖2B)。
為了將這些肽映射到最相關的結構上，作者解析了BD1和CFT-0380的復合物晶體結構，CFT-0380是CFT-1297的靶向配體彈頭。屏蔽肽都位于結合位點周圍的ZA環（殘基76?106），最大的屏蔽發生在αZ’螺旋上(圖2C，殘基88?93)。這個長環位于結合位點的下方，在沒有化合物的情況下顯示出顯著的氘攝?。?0-50%），這表明它在載脂蛋白狀態下是非常動態的。溶劑屏蔽數據表明，CFT-1297能顯著地穩定ZA環。
接著作者在HDX-MS實驗中用CFT-1297對二元和三元復合物形成中的溶劑屏蔽效應進行了深入研究。結果表明，CFT-1297不會使CRBN-DDB1產生額外的溶劑屏蔽。
圖2 HDX分析顯示結合到CFT-1297的BRD4 (BD1)的ZA loop上有明顯的屏蔽。圖片來源：ACS Chem. Bio.
HDX-MS揭示了由CFT-1297促進的三元復合物的蛋白?蛋白界面
結合HDX-MS和AlphaLISA的二聚化分析結果，作者清楚地觀察到了由降解物誘導的蛋白?蛋白界面促進的靶蛋白和連接酶蛋白上的額外屏蔽事件（圖3）。這一結果為每個蛋白質上的區域提供了有價值的信息，增強了對三元復合物的幾何形狀和空間偏好的理解。使用dBET6進行的三元復合物實驗沒有產生額外的屏蔽事件。
圖3.(a)用CFT-1297進行的三元復合物實驗, (b)BC loop環上可見三元復合物對BD1的屏蔽。?圖片來源：ACS Chem. Bio.
CFT-1297的三元復合物對接和HDX評分結果
CFT-1297和dBET6的HDX-MS特征對比表明，降解物和E3連接酶產生不同的三元復合物構象取決于降解劑的性質。理解和可視化這些構象可以為未來的降解劑設計提供重要的見解。為此，作者結合HDX-MS數據，開發了一個計算三元復合物的對接工作流程。該方法添加了HDX約束和更詳盡的構象采樣。
以CFT-1297的數據為例（圖4）進行了兩個實驗，分別采樣了10,000和100,000個降解劑構象。每個構象都與BD1結合位點內的目標配體結構對齊。一個CRBN晶體結構，通過甘氨酸突變的環來軟化柔性蛋白區域的沖突效應(基于CRBN結構集成分析)，然后通過共享的CRBN戊二酰亞胺結合基序疊加到每個傳遞的構象上。任何導致沖突的降解構象（范德瓦爾斯半徑為0.7）將在進一步的分析中被刪除。
圖4. 三元復合物(EDT)對接方法工作流程。圖片來源：ACS Chem. Bio.
蛋白?蛋白界面側鏈細化后，使用作者的HDX評分方法對得到的三元復合物進行排序，并使用ZRANK進行評分。HDX彼此間的得分和HDX與ZRANK之間的得分比對分別如圖5A、B所示。根據BRD4 HDX評分選擇了5種構象。這些三元復合物被分離出來并被覆蓋(圖5A，C)，顯示了一簇具有多個連接體取向的相關三元復合物。這五種三元復合物最有趣是因為它們的高靶標(BRD4) HDX評分，有利的ZRANK值，以及戊二酰亞胺以相同的方向聚集在一起，表明在一個類似的三元復合物周圍振蕩。
圖5. HDX-MS數據與計算分析過濾結果相結合結果。圖片來源：ACS Chem. Bio.
利用dBET23(PDB：6BN7)的三元復合物，將對接結果與晶體學數據進行了比較。選擇這種結構是因為它與CFT-1297有相同的輸出向量，更容易進行視覺比較。該結構的CRBN連接酶部分被作者將BRD4結構疊加到作者的對接模板上，并將對接結果作為HDX評分函數的輸入(圖5A，D)。在圖5D中，作者強調了來自得分最高的集群的模型如何與在HDX實驗中被屏蔽的BRD4(BD1)區域結合，同時6BN7以一種不能保護BD1域的構象扭曲。
結論
本研究表明，HDX-MS可以用于研究降解物誘導的三元復合物，當與約束對接結合使用時，提供了基于solution-state信息的三維模型。該方法被用于表征BRD4降解物CFT-1297和dBET6，它們表現出截然不同的氘吸收譜。三元復合物的結構和計算模型的發展是推進TPD領域的關鍵。HDX-MS數據很容易獲得，并在溶液狀態下提供有價值的信息。與計算分析相結合，可以通過識別新的模型和進一步的降解劑優化來加強三元復合物建模。
參考文獻
Eron SJ, Huang H, Agafonov RV, Fitzgerald ME, Patel J, Michael RE, Lee TD, Hart AA, Shaulsky J, Nasveschuk CG, Phillips AJ, Fisher SL, Good A. Structural Characterization of Degrader-Induced Ternary Complexes Using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry and Computational Modeling: Implications for Structure-Based Design. ACS Chem Biol. 2021 Nov 19;16(11):2228-2243. doi: 10.1021/acschembio.1c00376. Epub 2021 Sep 28. PMID: 34582690.