IsAb是一個專注于抗體重新設計的計算協議，主要是優化抗體序列。協議全面且免費，方便來自不同領域的用戶快速上手。
背景介紹
抗體重新設計是在已知抗體序列及結構的基礎上對其結構進行修飾。由于重新設計是基于已有的抗體，特別是經FDA驗證的抗體，因此設計的抗體產生免疫原性的可能性較小，可以更快地進行臨床試驗。重新設計很大程度上依賴于天然蛋白或交界面，主要側重于對抗體-抗原復合物的表面或內部進行改造，以獲得更好的親和力或提高復合物的穩定性。體內親和力成熟是獲得更好的抗體性能的重要方法，在免疫應答期間通過高頻突變(SHM)可將其親和力提高數倍。匹茲堡大學的謝祥群教授團隊開發的IsAb突破了結構的限制，即使在抗體-抗原復合物結構信息有限時，也可快速、免費地進行抗體設計。
抗體設計協議的工作流程
1.?獲得抗體和抗原的結構。這些結構可以來自PDB/自主解析。否則，可以從IMGT檢索抗體序列。
2.?使用RosettaAntibody web服務器進行抗體建模?？赏ㄟ^抗體序列生成其結構，并輸出一個松馳的結構。
3.?采用RosettaRelax方案，精修抗體和抗原的結構并提高對接精度。
4.?抗體與抗原對接。如果有抗體和抗原之間的結合信息，用戶可以跳轉到第5步。如果結構信息有限，抗體和抗原的結構可以提交到ClusPro來進行全局對接。
5.?局部對接?；谌謱咏Y果，使用SnugDock進行局部精修對接，允許交界面側鏈和CDR loop環的柔性，并輸出最終的抗體-抗原復合物。
6.?基于精修的抗體-抗原復合物進行丙氨酸掃描:(i)先將抗體和抗原界面上的殘基突變為丙氨酸，然后（ii）計算突變過程中殘基的能量變化，找出抗體上的熱點（hotspots），這有助于后續的抗體設計或為未來的研究提供思路。
7.?采用抗體親和力成熟方案設計抗體?；赗osetta評分函數，抗體親和力成熟方案將生成比原抗體具有更好親和力和穩定性的最佳突變抗體。IsAb方案中所有的代碼均進行了優化，以適應特殊要求。
圖1 工作流程。圖片來源：BIB
方案設計完成后，作者首先使用IsAb重新設計抗體D44.1，并將預測結果與報道數據進行比較，結果顯示，IsAb設計的結果可以較好地與實驗數據重疊，說明IsAb是一種可靠的抗體設計方案。隨后，作者以PD-1檢查點抑制劑Cemiplimab為例進行了重新設計。
案例學習
?Cemiplimab（西米普利單抗）設計步驟
Cemiplimab是FDA批準的一款PD-1免疫檢查點抑制劑，用于治療皮膚鱗狀細胞癌。然而，Cemiplimab沒有任何報道的三維晶體或者冷凍電鏡結構。另外，PD-1在不同情況下解析的結構顯示出其結構具有很大的柔性（圖2）。PD-1的C’D，N和FG loop環在與不同的抗體發生相互作用后可能發生巨大的變化。其與Cemiplimab的結合數據也暫無報道。因此，Cemiplimab的例子是處于沒有結構也沒有結合數據的極端情況。
圖2. 三個不同PD-1/抗體復合物的PD-1結構的重疊圖。圖片來源：BIB
第1-3步：PD-1和Cemiplimab結構的生成和準備
首先，作者收集了PDB數據庫中的PD1-抗體復合物晶體結構，并從其復合物晶體結構中提取PD-1結構，生成了三個代表性的結構。從IMGT獲得Cemiplimab的Fv序列，并提交至ROSIE。利用RosettaAntibody功能模擬Cemiplimab的三維結構，使用RosettaRelax方案準備抗原結構。隨后，將三個結構分別與Cemiplimab（Fv區域）進行對接。選擇10個輸出結果中得分最好的結果作為松弛結構。
步驟4：Cemiplimab -PD1全局對接
由于沒有Cemiplimab-PD1復合物的實驗數據，作者首先使用全局對接來生成表位信息和可能的結合位點。為了提高全局對接的準確性，作者將Cemiplimab的序列提交到Robin等人開發的抗體結合部位預測數據庫中預測位點。隨后，在Cluspro中輸入3個可能的PD-1結構以及預測的抗體結合位點，進行全局對接。作者從10個得分最高的結果中選取了可能的結合構象。每個對接特征將選擇一個可能的結合構象用于局部對接輸入。共選擇了三個結果，分別命名為模型1、2和3（圖3）。?
圖3. 全局對接生成的三種可能的結合姿勢。?圖片來源：BIB
如果已知抗體結合部位和表位，則可用PyMol構建局部對接的起始姿勢。對于計算方法來說， Parapred、Antibody i-patch以及一些像IEDB、Robetta等的web服務器是預測結合位點及表位的有效方法。結合部位以及表位的信息對于全局對接來說并非必不可少，但這些信息在對接中可以提高對接的準確性。結合部位和表位預測得越準確，起始構象的質量就越好。
第5步：Cemiplimab-PD1 局部對接
為了精修全局對接的結果，使用ROSIE web服務器的SnugDock 功能進一步進行局部對接。對接結果的接受標準為局部對接形成一個對接漏斗（N5＞3）。如果對接成功，并且最低I_sc 結果達到全局對接步驟提及的三個標準，那么最低的I_sc結果就是最終的局部對接結果。綜合以上規則，作者認為模型1和模型2的局部對接是成功的。
隨后，作者將模型1和模型2的序列與已發表的PD-1抗體結構進行了比較。結果表明，模型1的序列與nivolumab具有較高的相似性，輕重鏈相似性分別為64%和76%。重鏈具有更高的結合頻率，并在與抗原結合時提供更高的能量。因此，作者選擇模型1作為最終的結合構象。
結構分析表明PD-1的BC、N、FG和DE loop環均參與了與cemiplimab的相互作用。復合物交界面包含9個氫鍵和疏水相互作用。與跟nivolumab的結合不同，PD-1的 N loop環在與cemiplimab結合時沒有起到主導作用。相反，BC loop環在與Cemiplimab的相互作用中貢獻了大量的氫鍵相互作用(圖4)。
盡管N loop環沒有在結合中扮演主要角色，但其依舊貢獻了三個氫鍵作用。由殘基能量貢獻可知，重鏈上的殘基Y59、D57和N31對cemiplimab-PD-1復合物的能量貢獻較大(-3.697 kcal/mol、-2.721 kcal/mol、-2.118 kcal/mol)。此外, cemiplimab的Y59、D57、N31與PD-1的R30、N58/N102之間的氫鍵相互作用很強，其距離分別為2.6 ?、2.9/3.0 ?和3.4/3.0 ?。另一方面，N loop環上的P28和BCloop環上的R104與LCDR3和HCDR1間形成了強疏水作用。
圖4. Cemiplimab-PD1復合物間(A)氫鍵和(B)疏水相互作用。圖片來源：BIB
無論采取何種方式獲取輸入結構，輸入結構與天然結構越相似、對接的結果就越好。為了在Cemiplimab例子中進行對接結果過濾，序列比對可以幫助預測可能的最終復合物結合姿勢。在某些情況下，可能會有不同類型的對接結果（抗原結合在抗體的不同位置上，或者抗原以不同的結合姿勢結合在相同位置）。序列比對可能是決定最終構象的一個選擇。此外，如前所述，重鏈在抗體-抗原相互作用中起著重要作用。因此，作者建議在序列比對中優先考慮重鏈的序列相似性，特別是CDR區域的序列比對。
第6步：計算丙氨酸掃描
采用丙氨酸掃描預測cemiplimab-PD-1交界面熱點后，作者獲得了多個交界面氨基酸殘基的△△G。位于HCDR3上的兩個熱點殘基ASN101和ILE102，其△△G分別為1.799和1.552 kcal/mol。突變為Ala使得N101失去兩個氫鍵，這可能是結合能發生較大變化的原因。相反，I102與PD-1沒有形成氫鍵，但仍然導致了很大的能量變化。這意味著I102可能對復合物的穩定做出了貢獻。
第7步：Cemiplimab抗體計算的親和力成熟
基于對cemiplimab的了解，按照抗體親和力成熟方案進行計算的突變。作者首先嘗試將交界面殘基突變為20個蛋白氨基酸。cemiplimab上有17個殘基被突變，其中11個殘基來自重鏈。為了更清楚地查看結果，作者計算了突變的氨基酸殘基的分數變化。Y103A、I102T、G100D及F27S的突變在重鏈的突變殘基中具有最高的分數變化，N93Y、F32K的突變在輕鏈的突變殘基中具有最高的分數變化，大多數突變殘基位于cemiplimab的CDR區。這一結果與體內SHM的大部分突變主要積聚在cemiplimab的CDR和框架區域的現象一致。作者選擇分數變化最高的殘基來進行點突變。由于CDR H3區域在結合中起著重要作用，作者決定對H：Y103、I102、N101及G100殘基進行點突變。預測的結果顯示，兩種突變相對于原始氨基酸來說，其總體得分、結合親和力以及穩定性均更優。為了驗證這些預測，作者對這四種突變進行了MD模擬和MM/GBSA計算。?
圖5. 四種突變體的MD模擬結果和Cemiplimab對照的對比。圖片來源：BIB
圖5顯示，突變體G100A、N101G和Y103A提高了cemiplimab的結合能(總結合能-159.68 kcal/mol)，而I102T降低了cemiplimab的總結合能。有趣的是，結果表明，這三種體系比突變前的cemiplimab具有更好的靜電屬性，表明突變結構可能形成更多的極性的短程相互作用。G100A相對于對照組具有更高的構象熵變化和范德華能,這意味著G100A允許cemiplimab與PD1之間形成強的范德華相互作用。根據結構分析,作者發現N101G突變丟失兩個氫鍵(圖6)。對于疏水相互作用來說，G100A突變體依舊與PD1之間形成4?的疏水相互作用。IsAb預測與MD模擬結果之間的重疊表明了作者的方案是可靠的。
圖6. 對照組和設計組之間(A)氫鍵和(B)疏水相互作用的比較。圖片來源：BIB
參考文獻
Liang T, Chen H, Yuan J, Jiang C, Hao Y, Wang Y, Feng Z, Xie XQ. IsAb: a computational protocol for antibody design. Brief Bioinform. 2021 Sep 2;22(5):bbab143. doi: 10.1093/bib/bbab143. PMID: 33876197.