RNA結合蛋白Lin28是一種重要的多能因子，可重編程翻譯并促進癌癥進展。本文作者結合NMR結構數據、MD和細胞實驗，揭示了Lin28通過其冷休克結構域進入YB-1包裝的mRNA的機制。
背景介紹
并不是所有成熟的信使RNA進入細胞質后都會被翻譯。有些mRNA儲存在細胞質中到適當的時間和位置才激活。為了保持mRNA處于休眠狀態，mRNA被包裝成核糖核蛋白復合物（稱為“mRNPs”），使它們無法與核糖體接觸。mRNPs的主要蛋白質成分為YB-1（Y-box-binding蛋白質,YBX1基因），一個在細胞質中富集的mRNA-結合蛋白。YB-1可沿著mRNA進行非特異性聚合，形成不可翻譯的串珠結構，但當激活發生時，也能將mRNA展開成可翻譯的核蛋白絲。
本文探討了Lin28相關的mRNPs的結構-功能關系。Lin28（Lin28a）是胚胎發育過程中表達的重要重編程因子，與多能性有關。雖然Lin28一般不存在于成熟組織中，但會在幾種癌癥中重新表達，能促進癌細胞生長，對癌癥治療有一定耐藥性。為了研究Lin28在干細胞和癌細胞中的獨立功能，作者結合NMR結構數據、微管實驗以及動力學模擬，對Lin28和YB-1的作用機制以及其在細胞中的功能進行了探討。
正文
為了研究Lin28與YB-1的關系，作者首先使用微管網絡作為細胞內的工作臺，證明了Lin28與YB-1間在細胞質中的共定位。實驗發現，在HeLa細胞中，Lin28能混合于富含YB-1的區室，但不能與FUS, HuR, G3BP-1, LARP-6等其他RNA結合蛋白混合（圖1 a-c）。并且，這種共定位現象又再一次通過鄰位連接技術（PLA）實驗得到了再驗證（圖1 d）。?
圖1. 微管實驗和PLA實驗結果。?圖片來源：NCB
由于YB-1和Lin28的冷休克結構域（CSD）具有同源性，作者猜測CSD介導的與mRNA的協同結合可能為它們在細胞內的相互作用提供良好的結構基礎。為了驗證這個假設，作者表達了Lin28的兩種不同的截短體：Lin28-N-ter 和 Lin28-C-ter，并通過微管實驗證明了CSD在YB-1和Lin28共定位之間的關鍵作用。接著，又使用凝膠遷移實驗再次證明了這一想法（圖2c），提出CSD在二者結合之間的重要性。隨后，作者用核磁共振（NMR）分析了在單鏈核酸（RNA, ssDNA）存在的情況下Lin28與YB-1的相互作用（圖2a）。對Lin28-CSD和YB-1-CSD與ssDNA結合的對比分析表明，它們與單鏈核酸有著類似的結合模式（圖2b）。
為了進一步解釋YB-1和Lin28在長單鏈核酸上這種協同結合作用的結構基礎，作者使用了一個至少可接受兩個CSD的、20nt長的 Poly（C） ssDNA進行實驗。當15N-Lin28-CSD與20nt長的ssDNA 在YB-1-CSD濃度增加時相互作用，峰值強度下降（圖2d）。此外，峰高的降低主要發生在β-桶結構域的殘基上，表明CSD沿著ssDNA緊密堆積。?
圖2. Lin28和YB-1在單鏈核酸上混合的NMR分析。圖片來源：NCB
已知在CSD中與核酸相互作用的保守殘基顯示出在核酸存在時對Lin28和YB-1的類似化學擾動（CSP）。如圖3a和b，CSP分析顯示了許多可能參與Lin28和YB-1與ssDNA協同結合的殘基。接著在20nt Poly（C） RNA和ssDNA的存在下，作者添加未標記的Lin28-CSD或YB-1-CSD，對15N-YB-1-CSD進行了類似的NMR分析（圖3b）。CSP再次在相似的區域被檢測到，這些區域例如Lin28-CSD（例如Loop3），C端末尾的β-折疊3以及C端結構域（CTD），強調了這些區域在Lin28和YB-1單鏈核酸合作結合中的可能貢獻。?
圖3. 對Lin28殘基在Lin28和YB-1與單鏈核酸的可能的協同結合作用的鑒定。圖片來源：NCB
研究者發現，當多聚化時，在β-sheet 3的c端，Lin28的Q76/S77和YB-1的Q88/T89表現出CSPs（圖3b），暗示著它們可能對CSD與核酸的協同結合存在貢獻。作者還考慮了CTD開端的G114/V115殘基和兩個正電荷殘基R122/R123，它們可能對Lin28 CTD到連續CSD的靜電橋接做出貢獻。
隨后，作者在HeLa細胞中測量了YB-1和18個Lin28突變體的混合/分離。實驗結果顯示，YB-1與能與Lin28混合的很好，但是與陰性對照G3BP間顯示出明顯的分離感（圖4a）。對Lin28上的混合突變顯示，有6組氨基酸突變：F47A、Q76A/S77A、R85A、R85A/S86A 、K98A/K99A、R122A/R123A能顯著影響YB-1/Lin28的混合（圖4b-d），表明這些氨基酸殘基在二者結合之間的重要性。
圖4. 微管平臺實驗結果。圖片來源：NCB
研究者使用YB-1的三聚體與Poly（C）RNA的NMR結構，結合MD實驗，進一步研究了這些氨基酸殘基在YB-1和Lin28結合中的作用。研究者發現，Lin28-CSD能夠取代三聚體中的YB-1，同時保持相鄰YB-1-CSD與RNA的結合（圖5a，b）。此外，MD結果顯示，Lin28在RNA上形成了穩定的同源三聚體。Q76和S77在Lin28/YB-1或Lin28/Lin28界面上與RNA產生強烈的相互作用（分別為?104.25和?72.46 kJ/mol），對比陰性對照結果得出Q76和S77的作用為促進CSD與RNA的協同結合（圖5b）。
由于生成穩定三聚體的關鍵步驟也依賴于帶正電荷的CTD，而CTD需要指向位于下一個CSD附近的核酸主干，因此構成了YB-1和Lin28共享的橋接系統（CSD +一個帶正電荷的CTD）。這一觀點與Lin28 CTD （R122A/R123A）中和兩個帶正電的精氨酸殘基后觀察到的顯著分離作用一致，這些突變應該擾亂了CTD的靜電橋接。另外，當R85/S86突變為丙氨酸后，降低了Loop3的動力學，并修改了其與CTD殘基的相互作用。MD分析更傾向于認為Loop3中的K88-E91與位于CTD起始位置的I118-R122之間存在分子內相互作用（圖5a）。
實驗顯示，YB-1中與Lin28中保守殘基G119/S120對應的G135/S136的共振峰在Lin28存在時，分別重新出現或發生位移。根據MD結果，G135/S136也可能參與了Loop3與CTD之間的YB-1分子內相互作用。隨后，作者使用微管作為納米平臺，從實驗上探討了G119/S120在Lin28與YB-1及其自身混合中的作用。G119A/S120A雙突變誘導細胞內顯著的分離，證明Lin28 Loop 3和CTD前端之間的分子內相互作用在YB-1和Lin28之間的混合中發揮了關鍵作用（圖5c）。這些結果指向了一個分子內相互作用，負責指示CTD的方向，使YB-1和Lin28沿著mRNA的合作組裝成為可能。
圖5. ?Lin28和YB-1異質三聚體的MD數據表明了在RNA存在下YB-1和Lin28混合的機制。?圖片來源：NCB
作者使用免疫共沉淀實驗進一步分析了Lin28和YB-1相互作用的條件。結果顯示，Lin28和YB-1的協同結合只有在RNA存在下存在，并且雙突變體Lin28RS（R85A/S86A）及Lin28QS（Q76A/S77A）均顯示出對Lin28和YB-1協同結合的破壞（圖6a）。
應激顆粒是一種液體樣室，mRNA聚集在其中以重組對應激的翻譯反應。作者發現，與Lin28相比，在表達LARP6或G3BP-1的細胞中，YB-1在這些應激顆粒中的存在減少，YB-1與Lin28在應激顆粒中的結合相對更好（圖6b）。使用內源YB-1和Lin28突變體Lin28-RS和-QS研究YB-1/Lin28在應激顆粒中混合發現，Lin28-RS和-QS的突變微弱地改變了Lin28和YB-1之間的混合/分解，但沒有顯著破壞二者對mRNA的親和力，也沒有完全破壞Lin28和YB-1之間的相互作用，并且野生型和Lin28突變體的空間分布非常相似。
此外，作者使用CellProfiler軟件在單個細胞水平上自動測量了YB-1和Lin28在亞砷酸鹽處理的細胞的應激顆粒中的富集（圖6c），結果表明YB-1和Lin28在應激顆粒中的富集呈線性關系。
接著，作者通過siRNA降低YB-1的水平，進一步探究Lin28和YB-1在應激顆粒中的相互作用。如果富集在應激顆粒中的Lin28穩定了YB-1的存在，那么應激顆粒中YB-1的下降幅度應該小于細胞質中YB-1的下降幅度。結果顯示，通過siRNA降低YB-1的表達后，應激顆粒中YB-1的相對富集量有適度但顯著的增加。這種增加在Lin28-DE突變體（陰性對照突變體）表達時仍然顯著，但在Lin28-RS和-QS突變體中則不顯著（圖6c）。這證明Lin28-RS和-QS突變體與YB-1的弱結合可能與富含mRNA的應激顆粒有關。
除上述數據外，免疫共沉淀及RT-qPCR實驗共同顯示，野生型Lin28比Lin28-RS突變體對細胞mRNA的親和力更高（圖6d，由于Q76/S77與RNA相互作用，本實驗未考慮Lin28- QS突變體，圖5b）?？紤]到Lin28-RS和YB-1與mRNA的協同結合的改變，YB-1可能是Lin28-RS與mRNA結合的競爭對手。此外，通過siRNA降低YB-1的表達顯著增加Lin28-RS對mRNA的親和力，但對于野生型Lin28其對mRNA親和力沒有顯著影響，這可能是因為Lin28除了與不含YB-1的mRNA結合外，還與富含YB-1的mRNA結合（圖6d）。?
圖6. ?Lin28和YB-1在細胞中的相互作用。圖片來源：NCB
此外，作者還發現，細胞內Lin28的表達會抑制HeLa細胞的細胞增殖率，并且這一增殖率的降低可以隨著YB-1的表達減少部分恢復。YB-1過表達抑制了神經元的延伸，而Lin28能通過YB-1依賴的方式促進突觸的形成，而不是依賴或疊加效應。這也是對Lin28-YB-1與mRNP相關的可能功能的初步提示。
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討論
本文通過MD及細胞實驗揭示了Lin28和YB-1與單鏈核酸協作結合的分子機制，發現了Lin28與YB-1在應激顆粒中的合作關系，以及Lin28在HeLa細胞中對細胞增殖的依賴控制。通過對組織和胚胎發育過程中的基因表達的分析，指出了Lin28和YB-1在體內的功能聯系。最后，作者提出了Lin28和YB-1相互作用的機制模型，這將有助于進一步探索Lin28對癌癥和神經系統疾病的貢獻。
參考文獻
Samsonova, A., El Hage, K., Desforges, B.?et al.?Lin28, a major translation reprogramming factor, gains access to YB-1-packaged mRNA through its cold-shock domain.?Commun Biol?4,?359 （2021）. https://doi.org/10.1038/s42003-021-01862-3