引言
蛋白降解靶向聯合體（Proteolysis Targeting Chimera, PROTAC）是當前藥化領域熱門技術。通過連接體將靶蛋白配體與E3連接酶配體連接,招募E3至靶蛋白表面,引發多聚泛素化過程誘導蛋白降解，為小分子藥物的研發開辟了新的路徑。但是目前linker都是鏈狀分子，通過大環化作用限制分子的生物活性構象是合理設計功能性化學探針有吸引力的策略。作者首次提出大環PROTAC策略，基于VHL:MZ1: BRD4復合物晶體結構和分子動力學（MD）模擬輔助下，設計合成了一系列大環PROTAC，并通過晶體解析驗證了設計的合理性和MD模擬結果的可靠性。
先睹為快
單位與作者
英國鄧迪大學生物化學家Alessio Ciulli
蛋白靶點?
PROTAC分子MZ1與靶蛋白BRD4、E3泛素連接酶VHL的三元復合物晶體（PDB ID：5T35）
計算方法
二面角分析，分子動力學模擬
計算軟件
Jaguar 9.7 (Schr?dinger)，Glide Ligand Designer (Schr?dinger)，Desmond (Schr?dinger)
計算流程?
首先使用模型化合物N-乙基乙酰胺來計算JQ1酰胺中A和B位置烷基化引入的勢能變化，表明從B處衍生更合適；接下里確定連接區的長度，基于VHL:MZ1:BRD4的三元復合物晶體結構，作者Schr?dinger軟件構建了大環的MZ1衍生物，建模表明，包含3個PEG單元（化合物1）的連接體可以很好地容納在蛋白質之間形成的空腔中。最后，通過Desmond模塊對大環PROTAC分子VHL:1:Brd4BD2的復合物進行200ns的行分子動力學（MD）模擬，以研究三元體系在溶液中的行為，并取最后的50 ns用于數據收集和分析。
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大環PROTAC的構建和MD模擬
作者研究了PROTAC分子MZ1與靶點BRD4、E3泛素連接酶VHL的三元復合物晶體結構，發現MZ1的兩個配體部分（VHL配體，VH032和BET抑制劑，JQ1）在三元復合物中呈馬蹄形（圖1A）。因此，作者設想可以在MZ1的兩個配體部分之間添加第二個連接片段形成環狀化合物來設計大環PROTAC，將PROTAC分子構象鎖定在結合狀態來減少能量損失。
圖1.?基于結構設計大環PROTAC分子
圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.
將VHL配體上的酚羥基連接到MZ1連接體的第一個PEG單元，有兩個插入位置A和B（圖1B）。為了確定連接的位置，作者通過Jaguar 9.7 (Schr?dinger)軟件，使用密度泛函理論（DFT）對模型化合物N-乙基乙酰胺的烷基乙酰胺鍵進行了二面角扭轉掃描分析（圖1C）。結果顯示在A處烷基化的能量損失約為5 kcal /mol，并且這種修飾會阻止MZ1連接體采用晶體學構象，從而破壞結合模式，因此，從B處衍生更合適。
接下來，作者用Schr?dinger軟件構建了分別由3個和2個PEG單元組成的連接片段的大環衍生物1和2。建模表明，化合物2的連接片段太短，無法覆蓋兩個連接點之間的距離，相反，包含3個PEG單元（化合物1）的連接片段可以很好地容納在蛋白質之間形成的空腔中。最后，通過Desmond模塊對VHL:1:Brd4BD2的復合物進行200ns的行分子動力學（MD）模擬，以研究三元體系在溶液中的行為，并取最后的50 ns用于數據收集和分析。
MD模擬的結果分析
最后的50 ns用于數據收集和分析，每隔10 ns抽取一幀來觀察蛋白質-蛋白質和蛋白質-配體相互作用，并將抽取的結構進行疊加，時間間隔從藍色變為深紅色，網絡中的水分子在界面的特定位置形成團簇，表明它們在模擬過程中參與穩定與周圍環境的相互作用（圖2A）。在整個模擬過程中，三元復合物保持穩定，保留了晶體結構VHL:MZ1:BRD4中MZ1的結合模式及蛋白-蛋白和蛋白-PROTAC的相互作用（圖2B）。至關重要的是，模擬結果表明大環化反應與新連接體兩端的關鍵極性相互作用相容，包括JQ1的酰胺與BRD4- N433的水介導相互作用、MZ1中第一個PEG單元的氧原子與BRD4- H437的氫鍵和VHL-Y98圖2C）。
圖2.大環PROTAC分子MD模擬結果
圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.
為了驗證結合模式，作者接下來共同結晶了VHL:macroPROTAC-1:BRD4，并以3.5?的分辨率得到了三元復合物的結構。解析的晶體結構和MD模擬得到的復合物結構可以很好地疊合在一起（RMSD=0.6?）。大環PROTAC分子1的MZ1部分以相同的S型構象與未環化的PROTAC結合，保留BRD4-His437與PEG-3連接體上的氧原子之間的氫鍵。連接區的環化部分最佳地填充了BRD4的ZA-loop附近兩個蛋白質的界面產生的額外空腔（圖3A）。研究發現環化連接片段與ZA-loop有潛在沖突，這也可以解釋與BRD蛋白結合親和力的損失（表1）。在ZA-loop內，Leu387的側鏈以及Gly386和Leu385的羰基氧基均小于3.5?（圖3B）。與BD2相比，BD1和BD2之間的差異可能歸因于BD1的ZA-loop的差異，BD1中有額外的脯氨酸（Pro397），這可能限制了BD1適應大環PROTAC分子1。
盡管大環PROTAC分子1對BD2的親和力弱12倍，但其具有與MZ1非常相似的細胞活性，并且與MZ1相比，大環PROTAC能更好地區分高度同源的BET家族蛋白。綜上所述，環化PROTAC的設計策略有助于提高降解效能和同源靶點之間的選擇性。
圖3.?VHL:1:BRD4三元復合物的晶體結構
圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.
表1.?大環PROTAC與MZ1的熱力學參數對比
圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.
參考文獻
Testa, A., Hughes, S. J., Lucas, X., Wright, J. E., & Ciulli, A.Structure-Based Design of a Macrocyclic PROTAC.Angew. Chem. Int. Ed. 2020,59(4),1727-1734.