疫情當前，mRNA疫苗成了醫藥界的“頂流”，而沒有納米脂質顆粒(LNP)這項革命性的遞送技術，mRNA及人體基因編輯的技術路線將無法打通?；诤侠斫Y合實驗和計算方法的重要性，本文著重從計算角度介紹那些用于藥物和基因傳遞的新穎且強大的LNP系統。
背景介紹
脂質體的概念出現在1965年，20世紀90年代LNP在siRNA介導的體內RNAi方面開始嶄露頭角，被基因治療先驅確定為一種潛在的藥物遞送載體，2018年Alnylam公司利用該技術研發的全球首個治療ATTR的RNAi藥物patisiran獲批上市，最近更是因為輝瑞和Moderna的COVID-19疫苗的成功研發而獲得了極大的關注。如封面圖所示，LNP主要由四個成分組成：與核酸靜電吸附的離子化脂質、介導LNP內吞的膽固醇、加速藥物釋放的輔助型脂質以及提高納米粒整體穩定性的PEG脂質。大小在20nm到1000nm之間。其工作原理是LNP吸附到細胞表面，然后進行內吞作用并將基因藥物(mRNA, RNAi, CRISPR)釋放到細胞中。一旦核酸藥物進入細胞，細胞的陰離子脂質可能通過中和其陽離子脂質載體的電荷，破壞脂質載體與核酸之間的靜電相互作用，幫助從 LNPs中釋放核酸藥物。相對病毒載體而言，LNP具有基本沒有預存免疫原性、被天然免疫機制干擾的機制較少、不會被野生或重組的活病毒污染以及隨機整合到基因組的風險小等優勢。?
圖1. LNP作用機制示意圖。圖片來源于Precision NanoSystems官網
實驗測量所得的基于LNP的藥物遞送系統(DDS)性質在多重長度和時間尺度上和分子機制所得的存在一定差距，而計算方法尤其是多尺度建模和模擬可以彌補這一落差。本文著重介紹分子動力學在LNP模擬中的應用。
?
脂質雙層的分子模擬
為了合理設計和優化基于LNP的DDS，對小分子如何與脂質相互作用的分子級理解至關重要。這些相互作用會影響小分子在膜中的分配并決定特定LNP的載藥能力，其重要表征之一是滲透性，雖然總滲透率可以通過實驗測量得到，但滲透過程的動態過程及分子擴散和分配的比例確定卻主要來自計算研究。為了降低計算成本，通常采用脂質雙層貼片的原子模擬來推斷分子在脂質中的擴散和分配結果(圖2)。?
圖2. 在模擬中與脂質雙層相互作用的小分子。圖片來源于Curr Top Med Chem.
早期MD通過在脂質雙層內的給定位置約束小分子，通過對位置波動和維持位置約束所需的力的分析來計算擴散系數和分配自由能。模擬結果與實驗數據的比較表明，膜滲透率取決于多種因素。通常，親水分子在進入膜的碳氫化合物核心時會遇到自由能壘，而疏水分子往往位于膜的碳氫化合物區域。后來，Comer 和 Chipot提出了一個亞擴散模型，其中位置相關的分數階量化了分子的運動如何偏離沿膜法線方向的經典擴散(圖3)。通過研究短尾醇的同系物系列，他們首先表明通過雙層中心的自由能壘隨著脂肪醇鏈的長度增加而降低，與實驗數據在定量上一致。然后他們使用該模型來表明分子的滲透率主要由這種自由能差異決定，而分子之間靠近膜中心的分數擴散率是相似的，盡管它們的分子量和親脂性差異很大。該策略進一步發展為更經濟的膜滲透率計算?？梢酝ㄟ^一系列自由能擾動計算來計算自由能分布，并使用貝葉斯干涉通過一系列自適應偏置力計算來計算擴散率曲線。?
圖3. Comer的亞擴散模型。圖片來源于：10.1021/acs.jctc.7b00264
PEG化膜的分子模擬
PEG化已成功用于通過在脂質體表面形成保護性PEG層來增加藥物遞送脂質體的循環時間。PEG化膜減少了免疫細胞對藥物的攝取，然而其與周圍的各種分子的相互作用及空間效應尚不清楚。
MD在提供對PEG化如何提高膜的載藥效率的機制理解方面特別有用。Dzieciuch 等人用MD研究疏水性分子 p-THPP如何與脂質雙層相互作用，結果與實驗一致，p-THPP 進入兩性離子膜和聚乙二醇化膜。因此，與兩性離子脂質體相比，p-THPP 在PEG化脂質體中的溶劑暴露程度更高。類似的MD 模擬還表明，在生理條件下，PEG 傾向于纏繞在離子周圍，這增加了非極性乙烯基的暴露，從而增加了分子的有效疏水性。這種增加的暴露賦予了 PEG 分子對藥物分子（如血卟啉）的保護作用。針對其他LNP 成分也用類似的方法進行了研究。Magarkar 等人通過MD 模擬表明，PEG通過以與膽固醇分子的β片對齊的特定方式進入脂質雙層(圖4)。此外，PEG 會干擾膽固醇在膜結構中的作用；當膜被聚乙二醇化時，每個脂質的面積會隨著膽固醇的增加而增加。另外，增加 PEG 化脂質濃度會導致 PEG 層帶正電荷，從而削弱其與陽離子的相互作用，這為PEG化抑制鈣誘導的脂質體融合提供了原子級解釋。
圖4. PEG與膽固醇的β片平行進入脂質雙層。圖片來源于：10.1021/jp504962m
脂質體和膠束的分子模擬
目前全原子MD模擬尚無法探測脂質體的大規模的結構和動力學，例如形態特性、波動動力學和自組裝過程。研究人員嘗試以較粗的分辨率進行模擬來探索基于脂質的DDS。粗?；Ａ袅酥|體中單個分子的大部分結構和化學特性，同時提供了探索其生物動力學相關動力學的機會，例如囊泡形成、裂變和融合。
MARTINI CG模型已被廣泛用于構建各種大小的脂質體或膠束，這些模型可以評估脂質納米顆粒的物理穩定性。通過使用CGMD模擬研究高度彎曲的脂質體膜, Risselada等人揭示了一種普遍的堆積效應，在內部單層中發現緊密堆積的脂質頭部和無序的脂質尾部。通過混合 PC 和PE脂質，可以明顯觀察到兩種成分的部分橫向分層的趨勢，尤其是在內單層中富含PE脂質。這說明PE更喜歡內部單層的凹體積，研究人員基于此合理設計了用于siRNA的陽離子脂質。
CG模擬還可以被用于評估脂質體作為藥物載體的性能，例如用于光動力療法的金絲桃素，被發現更靠近外脂質層的極性頭部區域，并通過其更疏水的末端達到與脂質體內部的相互作用最大化(圖5A)。Menichetti 等人還進行了高通量CGMD模擬以篩選 119 個分子，并確定了與實驗確定的分配系數相關的有效分配自由能分布的關鍵特征。(圖5B)他們重新審視了Meyer-Overton 規則，發現化合物的滲透系數由其分配自由能和 pKa 常數決定，常用化學修飾可能無意中限制了滲透率范圍。在更大的長度和時間尺度上，可以用DPD和連續模型研究脂質囊泡在流體流動中的行為。
圖5. A.金絲桃素的CDMD模擬，圖片來源于：10.1021/ct400466m；B. 119種粗粒分子的三種轉移自由能之間的關系, 圖片來源于：10.1063/1.4987012
小結
分子模擬可以直接和間接地影響新型DDS的開發。雖然能夠直接預測LNP的穩定性和形態，但CGMD模擬更常用于提供對感興趣的膜系統的機理研究，例如結構特性、脂質-小分子相互作用，進而可用于指導LNP 成分優化或化學修飾以提高遞送效率。
參考文獻
Chan, C.; ?Du, S.; ?Dong, Y.; Cheng, X., Computational and Experimental Approaches to Investigate Lipid Nanoparticles as Drug and Gene Delivery Systems. Curr Top Med Chem 2021,?21?(2), 92-114.