引言
蛋白質療法的聚集穩定性一直是個巨大挑戰，例如用于糖尿病治療的胰島素在酸性pH值、溫度升高或攪拌下會表現出聚集現象，導致生產、儲存、純化和輸液過程中的復雜性。先前研究發現胰島素類似物的低聚集穩定性可能與胰島素單體形式參與聚集的早期階段有關，特別是折疊-展開途徑上的部分折疊中間體（PFI）。合理設計聚集抑制劑的一套方法包括開發破壞纖維的分子，例如設計肽或非肽β-片段類似物，以及篩選破壞芳香堆積相互作用的分子。最近，一種基于結構的計算機輔助設計，成功地擴展了篩選方法，從大量設計肽中識別新的抑制劑。本文設計早期聚集抑制劑的方法是基于破壞易聚集的胰島素二聚體。蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）已被證明通常由少量殘基介導，這就提供了用小肽取代大蛋白以模擬這些“熱點”殘基所產生的相互作用的可能性。
在本研究中，作者將N?PFI胰島素同源二聚體中天然單體（N）的結合界面殘基作為模板，設計對胰島素易聚集的PFI具有高特異性的肽。確定了一個最穩定的N?PFI同源聚體的集合，然后根據界面上埋置的殘基面積確定結合界面的熱點片段。首先根據與天然單體起始結構域的構象相似性，從這些天然單體的界面片段中篩選出肽。第二次篩選是通過選擇與源結構域相同的PFI殘基結合的肽，即模擬N-PFI界面上的相互作用。用尺寸排阻色譜法和遠紫外圓二色譜法分別評價所選肽對胰島素聚集和變性的抑制作用。通過等溫滴定量熱法評價了所設計肽的特異性及其膠束化熱力學。最后，用酶標儀分光光度法定量測定肽對HepG2細胞葡萄糖攝取的影響。
先睹為快
作者信息
印度理工學院化學工程系的Anurag S. Rathore和Gaurav Goel教授
蛋白靶點
胰島素的部分折疊中間產物（PFIs）
計算方法?
蛋白-蛋白對接，分子動力學
計算軟件 ?
HEX：用于生成N?PFI復合物的對接構象
PEPFOLD：用于生成每個肽的低能構象
GROMACS：用于分子動力學模擬
計算流程
基于先前對胰島素蛋白的模擬，篩選出14個PFIs結構，用于對接胰島素天然單體N，確定可能參與形成N?PFI復合物的關鍵殘基; 接下來，將N?PFI復合物的結合界面殘基作為模板，設計對PFI具有高特異性的肽，并利用累積結合界面面積ΔAsegmentN- PFI對片段進行排序; 經過進一步的篩選和修飾，選出三個9肽分子進行下一步功能驗證，并通過MD模擬證明了其與PFI可以穩定結合; 結合實驗結果，最終獲得了兩個可有效地抑制胰島素聚集的九肽分子:（R6）P3?(EAAYL?AGLY)、
（R6）P19（AAYLVAGLY）。
研究內容
作者先前研究了在淀粉樣蛋白形成條件下（PH 2，330K）測定了胰島素折疊結構上的五個亞穩態集合，一個最低自由能自然狀態，一個未折疊狀態，以及三個亞穩態中間產物。這些中間產物與胰島素聚集有關，相對于未折疊狀態具有更高的天然接觸，以下稱為部分折疊中間產物（PFIs）。每個PFI集合由一組動態的結構組成，吸引子（attractor）是系綜中最低的自由能結構。從三個PFIs集合中獲得了32 個PFI結構用于本文中的分析。使用gromos算法對這些PFI進行分組，得到14個簇PFI1-PFI14，Cα均方根偏差（RMSD）截止值為0.3 nm?；贑α接觸圖（距離截止，0.95nm）和殘基聚集傾向(A3D評分)，進一步評估14個PFI構象的結構相似性, 顯示這些PFI構象非常明顯（支持信息中表S1）。表現出完全的二級結構損失，并且比原生系綜具有更高的溶劑可及表面積SASA（支持信息中表S2）。圖1a和b分別顯示了最穩定溶液結構（自然系綜吸引子）和一個PFI中易聚集殘基的表面分布。圖1c顯示了14個PFIs中每個殘基的平均（μ）A3D評分和相關標準差（σ）。正如預期的那樣，PFIs中更大比例的殘基具有正的A3D評分，并且與原生狀態相比，總體數量也更高，說明具有大的正A3D值的殘基與蛋白質聚集有關。此外，PFI具有由空間連接的易于聚集的殘基形成的疏水斑塊，因此有望表現出更高的聚集傾向。作者還注意到，多個殘基具有大的相關標準差，表明PFIs的結合界面存在顯著的不均勻性。然而，差異主要在于A3D評分的大小而不是符號。同一組22個殘基在14個PFIs中有11個的A3D評分為正，而同一組16個殘基的A3D評分在14個PFIs中有12個為負（支持信息中圖S2）。此外，不同的PFI在運動上彼此可接近，因此，14個PFI可被視為一個單一的系綜來測定締合熱點殘基。??
圖1. 結構不同的PFI構象研究
圖片來源JCIM
天然單體與易聚集的中間產物的結合被認為是胰島素聚集的早期成核步驟。如圖2a中的程序示意圖，將天然單體與每個PFI對接（總共28個），以確定最有可能參與形成這種N?PFI復合物的殘基。通過剛性對接獲得的總共14000個N?PFI結構，使用gromos聚類法將其分為4353個亞組，Cα-RMSD截止值為0.3nm。利用給定簇中結構的結合自由能計算每個子集的簇自由能分數Gc。圖2c顯示，對于前幾個最穩定的簇，Gc有很大的增量，隨后的簇的間距要小得多。最穩定的團簇（最低Gc，如圖2b所示）的中心結構的穩定性通過GROMACS進行了分子動力學模擬進行評估。N和PFI單體沿垂直于結合界面的方向分離時，重組為二聚體，并且在5個獨立的200ns模擬中都保持完整。圖2b顯示了這種最穩定的復合物中的關鍵穩定相互作用，結合界面由來自天然單體N（I10、C11、S12、L13、Y14、L16、F22、V23、H31、L32、E34、A35和L38）的13個殘基和PFI（G1、I2、Q5、C6、C7、T8、H26、L27、C28、H31和E34）的11個殘基組成。天然單體中的大部分界面殘基屬于A鏈C末端的α螺旋（R12?R20）和B鏈α-螺旋（R30?R40），這兩個區域在低pH下參與胰島素原纖維的形成。進一步發現N?PFI復合物，主要由四對疏水殘基穩定，即L13N?I2PFI、L13N?L32PFI、F22N?L27PFI和V23N?L27PFI。作者還確定了H31N和T8PFI側鏈之間和Y14N側鏈與I2PFI主鏈之間的兩個界面氫鍵。H31被證明在胰島素核聚集的穩定中起關鍵作用，這表明在聚集過程中靜電相互作用的重要性。為了獲得更大的重要分子間相互作用的光譜，作者用15個最穩定的團簇的中心結構來識別N和PFI單體上的結合域。
圖3a，b分別顯示了15個N?PFI二聚體中天然單體和PFI的每個殘基的結合界面面積的平均值和標準偏差。N和PFI單體的標準化結合界面面積（ΔAiN- P F I）具有較大標準差表明結合界面殘基存在顯著的不均勻性。N和PFI單體分別具有43和50個不同殘基，其中至少一個二聚體具有正的ΔAiN- P F I。這些結果與PFIs中殘基聚集傾向的較大變化一致（圖1c）。
作者使用了平均15個N?PFI二聚體的ΔAiN- P F I作為確定聚集熱點的代理，圖3c，d顯示了ΔAN- P F I和MM/PBSA結合能之間的良好相關性。殘基L38、L13、H31、E34、I10、Y37、Y47和P49對天然單體具有最大的ΔAiN- P F I，殘基F46、Y37、I2、L27、E34、R43、F45、N18、Q5、H31、T48和C28對PFI具有最大的ΔAiN- P F I （見支持信息表S5），這些殘基之間的一些相互作用被認為是胰島素聚集核形成和原纖維形成的重要因素。結合界面上極性殘基的存在表明疏水和靜電相互作用將共同控制胰島素原纖維形成的初始階段。作者還發現N?PFI二聚體中的天然單體界面與胰島素的受體結合域有密切的對應關系，從而將胰島素的活性構象與其較高的聚集傾向聯系起來。以上結果表明，天然單體上相對明確的區域與PFIs的不同區域結合。此外，盡管在一級序列水平上結合界面的組成存在異質性，但這些不同區域在殘基極性方面具有相似的組成。?
圖2. 穩定的N?PFI二聚體研究
圖片來源JCIM
圖3. N?PFI二聚體中結合界面殘基的研究
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作者將N?PFI胰島素同二聚體中天然單體（N）的結合界面殘基作為模板，設計對胰島素易聚集的PFI具有高特異性的肽。利用累積結合界面面積ΔAsegmentN- PFI對片段進行排序。對于任何9-mer 片段，R31-R39具有最高的ΔAsegmentN- PFI=33.4；對于任何5-mer 片段，R10-R14和R45-R49具有最高ΔAsegmentN- PFI=22.2、14.4。涉及這些片段的蛋白間相互作用已被證明可以穩定成熟的胰島素纖維。來自這些片段的肽，被證明可以降低胰島素聚集率和/或增加聚集延遲時間。兩項研究中的肽，僅從天然單體的一個順序連接的易聚集區獲得，并與天然單體和PFIs結合。在本文研究中，作者利用空間上相鄰的，順序連接的片段來設計對胰島素PFIs具有更高特異性的肽。肽序列是通過連接兩個空間相鄰的片段在一個殘基對組成。這是通過根據殘基對的Cα原子之間的距離插入甘氨酸殘基、GA二肽或GAA三肽來實現的（見圖4a、b）。作者總共獲得了12101個長度為2-40個殘基的肽，利用序列中殘基對標準化結合界面面積（ΔApeptideN- PFI）的總貢獻排序。由于長度相似的肽被證明能有效地抑制胰島素聚集，因此其大小被限制在9個殘基范圍內。共得到665個ΔApeptideN- PFI 數值在9.8到34.5之間的九聚體，其中有20個較優的九聚體（見支持信息圖S4）。接下來去除順序相同的肽，獲得八個唯一序列，即P1、P2、P3、P13、P16、P18、P19和P20。
根據它們的構象和肽-PFI復合物構象對這八種肽進行下一步的篩選，綜合以下兩點（i）肽-PFI復合物具有良好的結合自由能；（ii）肽-PFI復合物與N-PFI二聚體界面處的PFI殘基高度相似，選出了高cosθ數值的肽P1（ICSLGAVLY）和P19（AAYLVAGLY），以及最突出的序列P3 (EAAYLAGLY)來表征抑制胰島素聚集的功效。肽P1、P3和P19的最低RMSD構象與天然單體的相應界面區域的重疊分別如圖4c-e所示。
圖4. 設計抑制聚集核形成的肽
圖片來源JCIM
圖5a顯示，這三個肽中至少有一個對每個N?PFI二聚體具有高cosθ。圖5b-d顯示了肽-PFI復合物和N-PFI復合物的重疊圖，分別對應于分別對應于肽P1、P3和P19的最高cosθ。正如預期的高cosθ，設計的肽模擬N?PFI相互作用，因此在與天然單體相同的位置與PFI結合。然而，所設計肽中高比例的疏水殘基使其與水性制劑不相容。使用Innovagen進行溶解度計算，建議插入三個精氨酸殘基增加水溶性。由于先前的研究表明以六聚精氨酸作為破壞結構域可獲得顯著的聚集抑制作用，作者在設計的肽的N端添加了相同的結構域。由較短片段組成的極性破壞結構域，對聚集抑制的影響較小。兩親性肽的最終序列為R6ICSLGAVLY（（R6）P1）、R6EAAYLAGLY（（R6）P3）和R6 AAYLVAGLY（（R6）P19）。作者進一步對三種肽結構中最穩定、最高的cosθ的肽-PFI復合物進行顯式溶劑MD模擬。通過軌跡分析，肽（R6）P1和（R6）P3保持與PFI的聯系與PFI結合（見支持信息圖S5），而（R6）P19先是遠離后再與PFI的重新形成接觸。
圖5. 肽-PFI和N-PFI界面的比較
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作者利用生物分析技術研究了設計的肽分子對胰島素穩定性和受體結合特性進行了評估。圖6a-c顯示單體胰島素的損失和寡聚物在肽存在和不存在的情況下的數據。所有三種肽都以濃度依賴的方式在不同程度上保留單體胰島素（圖6a），（R6）P1的有效濃度范圍存在顯著差異，與這些肽的膠束化行為有關。肽的最佳濃度配方的遠紫外鎘光譜如圖6d所示。綜上所述，上述數據表明肽（R6）P3和（R6）P19有效地抑制胰島素聚集，以單體形式保留90%的胰島素，并幾乎完全保留其天然的富含α-螺旋的構象。此外，長時間內單體損失率處于平穩狀態（圖6b），這表明了一種機制，即通過與抑制劑分子結合來隔離易聚集的PFI，抑制胰島素聚集成核的早期階段。為了進一步闡明（R6）P3和（R6）P19的穩定模式，作者使用ITC研究了它們與天然胰島素的結合（見支持信息圖S8）。ITC測量前后樣品細胞的SEC色譜圖（此處未顯示）重疊，表明整個測量過程中只存在天然胰島素單體。由于本研究中的肽和蛋白質在pH值范圍2?3范圍內都帶有高度正電荷，肽-PFI復合物的形成將以疏水相互作用為主，這可以解釋觀察到的最佳穩定濃度接近于每個肽的臨界膠束濃度。圖7顯示了不同胰島素制劑（含或不含肽）在412nm處的相對吸光度，這些數據與圖6中的數據一致。含有（R6）P3和（R6）P19的配方在培養72小時后仍保持78%和85%的胰島素活性，而對照胰島素配方（無肽）和含有（R6）P1的配方分別僅保留6%和20%的活性。
圖6. 設計的肽分子對胰島素制劑穩定性影響研究
圖片來源JCIM
?圖7. 設計的肽分子對胰島素制劑活性影響研究
圖片來源JCIM
結論
作者將N?PFI胰島素同源二聚體中天然單體（N）的結合界面殘基作為模板，理性設計了一系列對胰島素易聚集的PFI具有高特異性的肽，限制胰島素的同型二聚化。當肽/胰島素摩爾比分別為6:1和2:1時，15-mer肽（R6）EAAYLAGLY（（R6）P3）和（R6）AAYLVAGLY（（R6）P19）最為有效。這些肽組成的制劑以單體形式保留了>90%的胰島素，并且在淀粉樣變性條件下培養72小時后，在CD光譜中顯示出特征性的α-螺旋傾斜。在相同條件下，不含肽的制劑顯示單體胰島素和胰島素活性完全喪失。由與（R6）P3和（R6）P19組成的配方在72 h孵育后分別保留了78%和85%的天然胰島素活性，因此有希望進一步開發。
參考文獻：
Mishra, Avinash , et al. Structure-Based Design of Small Peptide Ligands to Inhibit Early-Stage Protein Aggregation Nucleation. J. Chem. Inf. Model. 2020, 60, 3304?3314