一種肽束縛策略，可用來篩選構象確定的多肽上的非天然側鏈片段。
背景介紹
合理設計的蛋白質二級和三級結構，可作為生物分子相互作用的調節劑?？刂频鞍踪|模擬設計的假設是，蛋白質表面的元素可以被縮小，以獲得細胞滲透性、蛋白質水解抗性的配體，這些配體保留了天然蛋白質的結合相互作用。然而，這些模擬物往往有一個固有的局限性：根據定義，蛋白質的最小模擬物并不包含蛋白質的所有接觸點，而接觸點的喪失與同源受體的結合親和力和特異性的降低有關。這一挑戰的潛在解決方案包括增強帶有親電彈頭的合成模擬物，以引起與受體的共價接觸或包含非天然側鏈，從而彌補由于無法與天然殘基接觸的口袋的非共價接觸而導致的結合親和力損失。
轉錄共激活因子CBP和p300的KIX結構域是轉錄因子的對接位點。圖1A顯示了在KIX的兩個變構連接面上結合cMyb和MLL的反激活域的NMR模型。一個轉錄因子與KIX的結合增強了另一個轉錄因子的結合，這突出了KIX的可塑性。KIX與異常轉錄因子的相互作用會導致基因異常表達和疾病。人們已開發了幾種方法，尋找一個或兩個KIX結合表面的配體以阻斷轉錄因子共激活因子的相互作用，這些方法包括結構引導設計、基于核磁共振的篩選、高通量篩選、噬菌體展示和二硫蛋白束縛等。由于KIX的柔性和其表面缺乏相鄰的結合袋，使得發現有效配體變得困難──從上述策略設計或分離出來的許多小分子和多肽，在高微摩爾到毫摩爾范圍顯示出弱親和力。
之前的研究中，研究者使用計算算法AlphaSpace來繪制蛋白質表面的地圖，并在模擬肽上設計自然和非自然的側鏈。該工具基于蛋白Voronoi圖的幾何特征開發，可用于蛋白表面結合口袋的鑒定，并設計非天然側鏈增強配體對這些未被充分利用的結合口袋的親和力和特異性。
AlphaSpace分析表明，幾個MLL殘基并沒有最優地占據KIX上最近的平坦口袋(圖1B)，而非自然殘基可以被設計成捕獲隱蔽口袋。應用AlphaSpace可以顯著改善最小MLL基序；優化后的序列具有多個非天然殘基，與較短的天然序列相比，與KIX結合的親和力為低微摩爾親和力。具體來說，計算設計預測S-芐基半胱氨酸(代替M850)、2-甲基苯丙氨酸(代替F852)、異亮氨酸(代替V853)和酪氨酸(代替T857)，可以成功占據KIX上的口袋(圖1B)。
圖1. KIX相關結構域和相關肽鏈。圖片來源：JACS
主要內容
美國紐約大學的Paramjit S. Arora等人以計算方法為基礎，描述了一種實驗片段篩選方法，以確定與KIX接觸的合成側鏈。在蛋白質束縛或位點定向配體的發現中，利用工程或天然半胱氨酸殘基與庫中的片段形成共價連接并引導單個片段進入鄰近的蛋白口袋。束縛增加了片段的局部濃度，與未束縛時相比，前者允許在較低濃度時對片段進行篩選。研究者設想肽束縛包括在合理設計的擬肽上放置反應基團，而不是蛋白質本身。在片段修飾的肽與蛋白孵育之前，該片段以共價方式連接到含有熒光團的肽上。片段對結合的相對影響通過熒光偏振分析來定量。計算分析表明，芳香族或脂肪族片段會導致結合增強，因為正在研究的口袋大部分是疏水性的?；谶@一假設，肽上的半胱氨酸基團被修飾成一個主要由脂肪族和芳香基團組成的片段庫。研究者在MLL肽上選擇了三個不同的位置進行優化。在單個位點獲得了KIX的亞微摩爾配體，從而得到了將識別側鏈片段能力提高超過2000倍的計算-實驗聯合策略。相關的研究成果以“Peptide Tethering: Pocket-Directed Fragment Screening for Peptidomimetic Inhibitor Discovery”為題發布在國際著名期刊JACS上。
圖2. 蛋白質、肽束縛以及實驗裝置。圖片來源：JACS
肽束縛篩選側鏈片段的MLL螺旋
研究者在MLL序列上采用肽束縛策略，以進一步改進計算過程。通過將先導線性肽轉化為共價約束螺旋模擬物來開展實驗篩選研究。用氫鍵替代(HBS)策略來穩定螺旋構象(圖3A)。AlphaSpace分析表明，原生殘基M850、F852、V853、T857和P858可以得到優化。用甲基苯丙氨酸和異光氨酸分別取代F852和V853，會導致同源袋幾乎被完全占據，但需要通過實驗篩選來確定850、857和858位置的最佳殘基。將側鏈片段篩選集中在計算優化的序列上，并尋找芐基半胱氨酸850、Y857和P858的類似物(圖3B)。研究者合成了三個親本HBS螺旋用于肽鏈篩選，半胱氨酸殘基分別位于850、857和858位。
圖3. 肽束縛篩選側鏈片段的MLL螺旋。圖片來源：JACS
作者創建了一個由芳香族和脂肪族片段組成的片段庫，用其初步分析肽栓系提供優化配體的潛力。在一鍋法合成中，烷基硫醇被預活化為5-硝基吡啶混合二硫化物(圖4B)。片段與熒光標記肽孵育，經質譜確認，稀釋后單獨與蛋白孵育，然后分析熒光偏振(圖2C)。熒光偏振測定提供了烷基化片段與KIX接觸的電位的直接讀數。
圖4. 相關片段的實驗研究。圖片來源：JACS
圖4C-E描述了850、857和858位點的片段篩選結果。柱狀圖顯示了15 nM肽庫和40 μM KIX的熒光偏振強度。850位點的篩選結果驗證了計算結果。值得注意的是，研究者發現該位點上的疏水殘基是有利的，這與之前對850位點上芐基半胱氨酸片段的AlphSpace預測一致。此外，實驗篩選顯示，環己基二硫片段20比芳香環更有可能在這個位置(圖4C)。受到850位點篩選結果的啟發，研究者評估了857和858位點的最佳片段。結果表明，環戊基片段21是857位點的首選候選(圖4D)，而碘乙酸片段13是858位點的首選候選(圖4E)。
非天然側鏈對MLL多肽結合親和力的影響分析
研究者重新合成了一種HBS螺旋結構，該螺旋結構包含了來自這三種篩選器的先導物片段，以評估肽束縛法獲得高親和力結合物的成功。研究者推斷，表面暴露的二硫鍵的有限穩定性可能限制了在生物分析中多肽模擬的潛力，并用碳氫鍵取代了用于片段篩選的二硫橋，從而獲得HBS II(圖5A)。接著，研究者評估了HBS II在競爭熒光偏振試驗中抑制KIX-MLL相互作用的潛力。HBS II顯示亞微摩爾抑制常數(Ki= 480±130 nM)，這相當于與野生型MLL序列(MLL847-858)的結合親和力增強約2000倍，與計算設計的多肽i相比，結合親和力增加約50倍(圖5B)。
圖5. 非天然側鏈對MLL多肽結合親和力的影響分析。圖片來源：JACS
研究者在HBS II的850、857和858位點加入了一個實驗篩選的單一片段，并測試了直接結合的能力(圖5C)。結果表明，每個片段提供了一個約2到4倍的改進，與多價體系一致，每個接觸點提供了一個小的結合能增益。這種結合模式支持了多個片段的加和效應，可以提供高親和力配體的假設。
最后，研究者利用HSQC 15N核磁共振波譜滴定法，來評價HBS II在KIX上的結合位點。將0.5 mol和1 mol等量的HBS II加入到15N標記物中，會導致位于KIX MLL和cMyb面上的KIX主酰胺質子的化學位移發生變化(圖6A)。圖6B顯示了MLL/KIX/cMyb蛋白復合物(PDB 2AGH)上主鏈酰胺的化學位移變化。結果表明，K659的位移最大，它位于MLL的鏈部附近，預測會與HBS II的850位接觸。
圖6. 相關實驗測定。圖片來源：JACS
總結
本文介紹了一種計算和實驗相結合來開發具有非典型側鏈的蛋白質類似物的方法。計算方法AlphaSpace提供了蛋白質表面的地形圖，并確定了未被充分利用的目標口袋，這些口袋可能被非自然側鏈基團更好地占據。在計算方法的基礎上，用實驗方法篩選結合在特定的口袋側鏈片段。研究者用該方法成功開發出KIX的肽擬似物，一種很難用傳統設計和篩選策略開發的共價激活劑。與野生型序列相比，親和力提高了2000多倍，從而促進了亞微摩爾抑制劑的KIX/MLL絡合物的形成。
參考文獻
Modell, Ashley E., et al. “Peptide Tethering: Pocket-Directed Fragment Screening for Peptidomimetic Inhibitor Discovery.” Journal of the American Chemical Society 2022 144 (3), 1198-1204 DOI: 10.1021/jacs.1c09666