JCIM | SARS-CoV-2主要蛋白酶非共價抑制劑的高通量虛擬篩選與驗證

背景介紹

為了尋找新型冠狀病毒大流行(COVID-19)的治療方案，科學家們利用現有開發的針對SARS和中東呼吸綜合征的治療方案，發現了超過15種在病毒的復制中發揮著重要作用的病毒蛋白。在這些蛋白中，M^pro是一個很有吸引力的藥物靶點，因為它在病毒復制中起著關鍵作用，且在人類基因組中沒有任何密切相關的同源物。但識別SARS-CoV-2 M^pro的非共價抑制劑一直是一個挑戰，因為其主要結合位點的內在柔性。

在本文中，美國國家虛擬生物技術實驗室（NVBL）的Austin Clyde等人描述了利用HTVS平臺發現非共價抑制劑的過程，該平臺使用了超級計算機資源、集成對接策略、高通量實驗篩選、X射線晶體學和分子動力學模擬（MD）。作為眾包方法的補充，以及潛在O（十億）化合物的HTVS，作者用了一個由MCULE庫中650萬庫存化合物組成的庫。使用M^pro的晶體結構進行了集成對接，對兩個流行的對接程序(Autodock-Vina和OpenEye FRED)的Top評分化合物進行了實驗表征。最終發現了一個Ki為2.9μM的抑制M^pro的分子，并解析了其1.8?的室溫X射線晶體結構。另外使用MD模擬來表征其與M^pro活性位點的結合機制，同時改變了酶的整體構象動力學。這份工作流程為快速發現針對SARS-CoV-2的可行先導分子提供了一個可擴展的框架。

On-Demand小分子庫HTVS篩選M^pro抑制劑

作者首先從Mcule的可訂購的On-Demand化合物庫中對SARS-CoV-2的主要蛋白酶M^pro進行對接篩選。鑒于M^pro四個保守的結合位點(S1’、S1、S2和S4) 的內在柔性，作者使用五種不同的晶體結構，采用集成對接方法，使用了OpenEye Scientific FRED工具包中的對接方案和評分功能。

在5個結構、兩個復合庫和兩個方案上，總共計算了超過6300萬個對接。圖1a總結了整個工作流程。流程部署在Argonne和Oak Ridge Leadership計算設施(ALCF/OLCF)的HPC資源上，使用了Theta和Summit超級計算機及德克薩斯高級計算中心(TACC；Frontera)和圣地亞哥超級計算中心(SDSC；Comet)。生成的對接庫（包括準備和對接腳本）和對接分數可以作為一個可下載的數據集使用。

根據對接分數、肉眼檢查和化合物的可得性對得到的化合物進行排序，并對選定的化合物進行實驗驗證。結果發現，每個晶體結構之間的對接得分分布略有不同(圖1b，c)，因此作者檢查了總體分布的前0.1%。受體各自對接之間的相關系數最高為0.85（7BQY和6LU7），最低相關系數為0.001（6W63和7JU7）。

事實上，6W63的對接結果相對于其他4個受體是一個離群值，其相關系數最高僅為0.003?？紤]到受體之間對接結果的差異，作者通過取可用系列中的最小值來創建一個一致性分數。OpenEye FRED有大范圍的分數。受體之間的微小空間差異會導致很大的數值差異。如圖1c所示，與使用單個樣本相比，一致性得分的相關性存在顯著差異。

圖1.（a）HTVS工作流程圖；（b）Chemgauss4分數分布；（c）一致性評分。圖片來源：JCIM

MCULE-5948770040作為?

SARS-CoV-2M^pro抑制劑的實驗驗證

基于上述一致性評分程序，使用前20個不同的M^pro晶體結構，從Mcule數據庫中選擇了116個化合物進行實驗篩選。在這116個化合物中，有5個無法排序，15個屬于PAINS而被排除，最終有72個被交付。隨后，作者對這些化合物進行初步的SARS-CoV-2 M^pro活性抑制篩選，篩選后與酶預孵育，并確定FRET肽裂解的初始速度。如圖2，至少有7種化合物的抑制率為25%，其中MCULE-5948770040在20μM時的殘留活性最低(12%)。

作者隨后在40μM底物下測定了MCULE-5948770040體外Mpro抑制的濃度依賴性，IC50為4.2μM。在40μM未標記肽底物上也進行了基于正交定量高通量MS的終點分析，得到相似的IC50為2.6μM。另外，在20?500μM的底物和0?25μM的抑制劑下測量的初始速率與Ki為2.9μM時的競爭性抑制機制相一致。

圖2. 候選化合物的抑制活性。圖片來源：JCIM

M^pro與MCULE-5948770040配合物的

X射線晶體結構

為了闡明抑制的分子基礎，作者解析了在近生理（室溫）溫度下M^pro與MCULE-5948770040的1.8?的X射線晶體結構。復合物結晶為生物學相關的同源二聚體，如圖3。每個原聚體由三個結構域組成(I?III)。底物結合的裂縫在催化結構域I和II的界面上形成，而α-螺旋結構域III形成一個二聚界面。底物結合裂縫位于酶表面，分別在S1’?S5亞位點的P1’?P5位置容納氨基酸殘基或抑制基。由Cys145和His41組成的非典型催化二分體位于底物結合裂縫的深處，在C端P1’和N端P1位置之間進行肽鍵裂解。

根據晶體結構，MCULE-5948770040非共價結合到Mpro的活性位點，占據S1和S2的亞位點（圖3a,b）。該配體的尿嘧啶P1基團位于由極性接觸驅動的S1亞位點。His163咪唑側鏈的N?2與尿嘧啶取代基第4位的碳基形成緊密的2.6? H鍵。His163之前被中子晶體學確定為在Nδ1上的單質子化，表明在配體結合時，His163側鏈的質子化態可能被重排。Mpro的特征是由Gly143、Ser144和Cys145的主鏈酰胺NH基團在S1亞位點堿基上形成的氧陰離子空穴。將P1尿嘧啶連接到MCULE-5948770040的中心哌嗪連接體的碳基位于氧陰離子孔的外圍，與Gly143形成直接的2.8?氫鍵。

MCULE-5948770040復合物與Mpro的LF聯合中子/X射線晶體結構的疊加顯示，P2-二氯芐基進入疏水S2口袋，改變了Met49側鏈的位置 (圖3c)。MCULE-5948770040與Mpro活性位點的結合導致His41側鏈翻轉和χ2角旋轉，為復雜結構中與P2-二氯苯的π?π堆積創造了有利的幾何結構。His41上的構象變化使得His 41 Nδ1與Mpro結構中常見的保守的催化水分子（H2O cat）之間形成保守的氫鍵，但直接用連接His164的主鏈羰基的氫鍵取代它會導致額外的水分子從大體積溶劑中招募，與His咪唑環形成氫鍵。

計算預測的MCULE-5948770040與Mpro活性位點的結合姿勢與實驗確定的取向一致(圖3d)。僅在哌嗪linker和p2-二氯芐基中存在微小的差異。哌嗪linker在晶體結構中被最優化為一個椅式構象，而對接的幾何形狀得分最高的采用了一個扭曲的船式構象。

圖3.M^pro與MCULE-5948770040復合物晶體結構，以及與LF和對接結構的比較。圖片來源：JCIM

MD 揭示M^pro與MCULE-5948770040的互作機理

為了解分子如何與M^pro結合位點相互作用，作者進行了μs時間尺度的原子MD模擬。對于LB態模擬，模擬了兩種M^pro原聚體中存在的配體。作者觀察到配體仍然與主要結合位點結合(對于二聚體中的A鏈和B鏈)，該蛋白也沒有發生任何較大的構象變化。

作者使用LF和LB M^pro模擬中的均方根波動(RMSFs)(圖4a)來了解配體是如何影響構象動力學的。為了方便，作者單獨考慮了每個原聚體（模擬是以配體結合活性二聚體形式進行的），并觀察到M^pro的幾個不同區域表現出改變的波動。在作者所有的副本中，二聚體A鏈中的RMSFs略高于B鏈。值得注意的是，并不是所有的區域在每個原聚體中都表現出穩定性(例如，S4區域，原聚體鏈A表現出與LF狀態相似的波動)。有趣的是，遠離結合位點的區域，包括每個原聚體的結構域III（圖4中的R5），在LB模擬中表現出較低的波動。

圖4. MCULE-5948770040與M^pro結合時的構象變化表明了不同區域內的變化。圖片來源：JCIM

為了闡明受配體的結合影響的運動，作者使用了支持非諧構象分析的自編碼器(ANCA-AE)，將LF和LB模擬所跨越的構象嵌入到一個低維集合中(圖4b)。作者的模擬可以嵌入到一個10維的集合中，這很好地解釋了蛋白質所經歷的構象波動。在這些嵌入中，LF和LB模擬占據了不同的投射，LF模擬采樣了不同的構象狀態(通過RMSD對LB狀態進行量化)。LB模擬中主要的構象變化局限于跨越S1—S4和R5的結合口袋，如圖4c，d中原聚體A所示，沒有觀察到相對于原聚體B的顯著運動。觀察到的波動主要是由于原聚體A內的配體從其主要相互作用位點(P1和P2)重新定位到互補位點。P1-尿嘧啶與S4區域（殘基）形成了新的相互作用，而P2-二氯芐基則保持結合在疏水口袋內。

雖然作者沒有在晶體結構中觀察到這種配體的位置，但這些配體運動在作者模擬的多個副本中普遍存在，并可以在尿嘧啶和蛋白質側鏈之間形成穩定的相互作用。與這些變化相對應的是，蛋白質結構域III的運動(圖4c，d）也被抑制，表明該區域可能在配體結合時穩定下來。作者還從LB模擬中檢測了配體與蛋白質之間的氫鍵模式，發現原聚體B鏈中配體與蛋白質之間的氫鍵比A鏈中的氫鍵更穩定。

討論

本文描述了發現新型M^pro非共價小分子抑制劑的過程?；衔锊捎每蓴U展的HTVS框架和MCULE靶向性化合物庫獲得。生化分析驗證了該M^pro抑制劑的抑制常數(Ki)為2.9μM。X射線晶體學確證了化合物與M^pro的結合模式，以及穩定的氫鍵和疏水相互作用。分子動力學模擬和機器學習闡明了結合配體是如何改變M^pro的構象狀態的，包括結合位點的近端和遠端運動。為M^pro非共價抑制劑的進一步設計奠定了基礎。

參考文獻

Clyde A, Galanie S, Kneller DW, Ma H, Babuji Y, Blaiszik B, Brace A, Brettin T, Chard K, Chard R, Coates L, Foster I, Hauner D, Kertesz V, Kumar N, Lee H, Li Z, Merzky A, Schmidt JG, Tan L, Titov M, Trifan A, Turilli M, Van Dam H, Chennubhotla SC, Jha S, Kovalevsky A, Ramanathan A, Head MS, Stevens R. High-Throughput Virtual Screening and Validation of a SARS-CoV-2 Main Protease Noncovalent Inhibitor. J Chem Inf Model. 2022 Jan 10;62(1):116-128. doi: 10.1021/acs.jcim.1c00851. Epub 2021 Nov 18. PMID: 34793155; PMCID: PMC8610012.