通過實驗結合計算的方法，證明了四環素衍生物對FP-2的變構抑制作用，預測了可能的結合模式，為進一步優化四環素骨架及發現選擇性更好效力更強的抑制劑奠定了基礎。
背景介紹
惡性瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶falcipain -2（FP-2）被認為是開發新抗瘧藥物的潛力靶點。多年來，許多FP-2高效抑制劑因其對人類組織蛋白酶脫靶的低選擇性而均未進入臨床。
FP-2屬于C1半胱氨酸蛋白酶家族，這種酶顯示出瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶共有的兩種獨特的結構特征：“鼻狀”N-端延伸(FP-2鼻)和突出到溶劑中的β-發夾?(FP-2臂)。缺失分析表明，FP-2鼻是重組酶正確折疊所必需的，FP-2臂是血紅蛋白的遠端識別位點，當臂缺失時會失去血紅蛋白酶活性。目前為止，絕大多數已知的FP-2抑制劑都是正構或競爭性抑制劑。阿根廷圣馬丁國立大學的Emir Salas-Sarduy團隊之前的研究發現四環素系列的抗生素甲烯土霉素是FP-2的弱非競爭性抑制劑，表明變構可以作為一種抑制FP-2的替代機制。
變構位點通常在進化上不那么保守，因此它們提供了一種跨受體家族實現亞型選擇性的途徑。此外，它們允許調節蛋白質活性（而不是完全廢除），這可能有利于恢復生理系統的良好功能。較正構藥物而言有更多實質性的優勢。
文中，作者評估了四環素家族其他成員對FP-2的抑制活性，即四環素、土霉素、金霉素、多西霉素和米諾環素（圖1），并確定其抑制機制。確定該系列的活性不僅可以作為構建結構?活性關系的起點，還可以為闡明其結合位點提供線索，也可以為設計新的、更有效的變構抑制劑奠定基礎。
化合物的發現和機制確證
首先，作者通過實驗的方法確定了FP-2可以被幾種四環素衍生物所抑制，并且具有亞摩爾級別的親和力。這些化合物均表現出獨特的非競爭性抑制劑模式，在亞摩爾范圍內都表現出高度相似的Ki值，α值范圍為0.6-0.9。（圖1）
圖1. 四環素衍生物的結構及其抑制FP-2的實驗結果。圖表來源：JCIM
四環素衍生物的非競爭性抑制確證
根據已有的非競爭性抑制劑EC48與FP-2的共晶結構（PDB：6SSZ），作者分析了四環素衍生物與FP-2非競爭性結合的機制。作者使用一個大的FRET底物進行了抑制實驗。FRET底物長28個殘基，最早用于開發FP-2的異質酶分析方法。FRET理論上可以完全阻斷EC48樣的結合模式，阻止四環素衍生物與FP-2活性位點的S側的結合，并以高濃度這種經典競爭方式取代它們。
作者分析了所有化合物在三種不同濃度的FRET底物下的劑量?響應曲線，并計算了最高(5×KM)與最低(0.25×KM)底物濃度的實驗IC50比值(REXP)（圖2），用于對每種四環素衍生物的抑制機制進行分類。在所有情況下，REXP值顯著低于競爭性抑制劑理論預期的值(RTHEO=4.8)，更接近非競爭性抑制劑?(RTHEO=1)。有趣的是，三種抑制劑顯示REXP<1，金霉素在該系列中REXP值最低，與該化合物的最低α值一致。這表明金霉素對酶?底物復合物的結合偏好，是一種非競爭性樣行為。
結果表明，與底物長度無關，四環素衍生物是FP-2的非競爭性抑制劑。因此，混合抑制劑EC48觀察到的與S’側的結合被排除。因此，作者隨后使用了計算的方法來預測所研究的四環素衍生物最有可能的結合位點。
圖2. 使用FRET做底物，四環素衍生物的非競爭性抑制確證結果。圖表來源：JCIM
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MD模擬和自由能計算預測四環素衍生物
與FP-2遠端變構位點的結合模式
將配體放置在遠離蛋白質表面的不同位置后，通過多個2μs MD模擬研究了甲烯土霉素與FP-2的結合模式。通過計算分析，確定了甲烯土霉素與FP-2的最低能量結合模式為A.11.0。
圖3. ?MD模擬中甲烯土霉素與FP-2的主要結合模式。圖片來源：JCIM
FP-2:甲烯土霉素復合物的預測結構表明，甲烯土霉素結合了一個遠離活性位點凹槽的變構位點，與非競爭性抑制機制一致(圖4A)。結合位點相當于先前表征的同源蛋白酶人組織蛋白酶K(hCatK)的變構位點，稱為位點6。此外，在變構位點界面觀察到的關鍵相互作用屬于保守的四環素骨架，而可變區域主要暴露在溶劑中。這一特征是解釋這里研究的所有四環素衍生物的類似抑制效力的基礎。
圖4. 預測的結合模式。圖片來源：JCIM
在識別最低能量的甲烯土霉素結合到位點6后，作者通過在分解轉換期間增加λ窗口的數量，運行復制MD模擬，并將模擬時間從10ns延長到30ns，對該復合物的ΔG0bind值進行了精確的計算。最終得到FP-2：甲烯土霉素復合物的ΔG0bind值為?5.7 kcal/mol，比簡化方法計算的大2.4 kcal/mol，與Ki估計的實驗親和力(?5.2 kcal/mol)非常一致。改進后的方案允許獲得一個可靠的ΔG0bind,calc值，其誤差相對于實驗值< 1 kcal/mol，這提高了預測結構的有效性。
作者隨后通過計算二甲胺四環素的ΔG0bind值，來評估四環素支架可變區域的化學修飾對FP-2親和力的影響。選擇二甲胺四環素是因為它與甲烯土霉素相比具有最顯著的結構差異。使用構建的FP-2：二甲胺四環素結構模型進行的TI自由能計算表明，ΔG0bind,calc值為?5.0 kcal/mol，與實驗值相匹配（?5.1 kcal/mol）。因此，所提出的結合模式至少與兩種明顯不同的四環素衍生物所顯示的FP-2的類似實驗親和力相一致。實驗測量結果證實了化合物在溶劑暴露的可變區的修飾幾乎不會改變其對FP-2的親和力。
計算分析甲烯土霉素對FP-2活性位點的修飾
作為變構抑制劑，當甲烯土霉素結合于位點6時可能會擾亂FP-2的構象平衡。作者結合群落和信號通路分析來調查這一現象。CA采用蛋白的網絡表示，其中Cα原子對應于由表示成對關聯的邊連接起來的節點。這個網絡聚集在高度相關的殘基組中，這些殘基的集體運動與蛋白的其余部分的耦合更松散，形成所謂群落。另一方面，通路分析通過計算連接兩個區域的信號通路如何在蛋白質結構中傳播，揭示了變構位點與活性位點的耦合。通常，這些技術依賴于從所研究系統的MD軌跡計算出的相關矩陣。
使用0.5截止值和接觸圖過濾，過濾原始相關矩陣后進行CA。網絡被劃分為最小數量的群落，在0.01的容忍范圍內最大化模塊化。作者發現，在存在甲烯土霉素的情況下，FP-2被分成8個群落，比游離狀態多一個(圖5A)。結合甲烯土霉素后，FP-2群落顯著重組，包括那些形成活性位點的群落。
圖5. 計算分析甲烯土霉素對FP-2變構抑制作用的分子基礎。圖片來源：JCIM ?
作者通過計算E138到C42之間的信號通路，分析了在甲烯土霉素存在和缺失兩種情況下活性位點和位點6之間的聯系?；贓138與甲氧環素的多重氫鍵結合，選擇其作為源殘基（source residue）(圖5B)，它很可能在配體與變構位點的結合中發揮關鍵作用。另一方面，C42是主要的催化殘基，負責對底物的易剪肽鍵的親核攻擊。此外，C42和E138分別位于相反的區域(L和R)，這意味著計算的路徑將顯示變構信號如何通過FP-2的域間空間傳播到活性位點。這兩個特征使作者選擇C42作為合適的sink residue。
分析結果表明，甲烯土霉素在結合時干擾了與活性位點耦合的變構位點，不僅干擾了介導這種聯系的殘基，而且還干擾了游離和復合物狀態時的FP-2的路徑長度分布。另一個分析這種變化的方法是通過確定信號路徑上的節點簡并度，即在兩個系統中，特定殘基在整個計算路徑集中出現的次數。從圖5E可以看出，R141、F142、L143、G144、P145和A175在自由FP-2中參與的信號傳播明顯多于FP-2:甲烯土霉素配合物。相反，L140、I148和H174在后一種體系的路徑中被過度表示(圖5C、E中加粗標記的殘基)。這些結果進一步說明了甲烯土霉素對活性位點和變構位點之間聯系的影響。
討論
本文首先通過實驗證明了具有四環素骨架的化合物以非競爭性的方式抑制FP-2，Ki值在121~190μM之間。再通過計算的方法，研究了配體結合時的結構修飾作用。結合配體向蛋白質表面自由擴散的長MD模擬和精確的結合自由能計算，構建了一種強有力的計算方法，可以預測這些化合物的結合模式，結果與一些實驗結果一致。此外，生成的結構是一個有價值的起點，可以優化四環素骨架實現更有效的抑制以及對該變構位點使用虛擬篩選方法來發現新的FP-2抑制劑。
參考文獻
Hernández González JE, Alberca LN, Masforrol González Y, Reyes Acosta O, Talevi A, Salas-Sarduy E. Tetracycline Derivatives Inhibit Plasmodial Cysteine Protease Falcipain-2 through Binding to a Distal Allosteric Site. J Chem Inf Model. 2021 Dec 28. doi: 10.1021/acs.jcim.1c01189. Epub ahead of print. PMID: 34962803.