背景介紹
自從人們認識到藥物結合動力學速率可能是體內藥物功效的關鍵決定因素，對開發計算方法的興趣就日漸增加，以期能估計出藥物-靶標解離速率常數 (koff) 或停留時間 (τ= 1 /koff）。業界已有的能預測動力學速率并推導出定量結構-動力學關系 (QSKRs)的方法大多依賴晶體結構而每個配體-蛋白復合物只能被視為具有單一結構。海德堡理論研究所的Wade教授團隊提出了比較結合能量（COMBINE）分析的改進方法，在COMBINE分析中引入了使用多個結構來描述每個配體-蛋白質復合物的選項，并將其應用于研究蛋白質結合口袋柔性對p38絲裂原活化蛋白 (MAP) 激酶抑制劑的解離速率常數 (koff) 推導的影響。通過對從分子動力學模擬獲得的蛋白質構型進行對接，為每個配體-蛋白質復合物獲得了多個結構，然后通過最小二乘回歸獲得從配體-蛋白質復合物的能量最小化結構確定的配體-蛋白質相互作用能的比例系數，進而用于計算koff值。本文研究旨在擴展COMBIE分析方法，以允許使用一組結構來代表一個配體-蛋白質復合物，從而將結構柔性的影響納入結合參數的預測中。作者建立了兩個COMBINE分析模型來預測koff值：一個使用能量最小化的晶體結構來表示每個配體-蛋白質復合物，另一個使用來自MD模擬的用于集成對接的10個結構來表示每個配體-蛋白質復合物。通過選擇p38絲裂原活化蛋白 (MAP) 激酶作為模型系統，由于其實驗koff值的范圍和晶體結構的可用性，證明了COMBINE分析是一種很有前景的方法，可以指導設計一些能以改進的結合動力學結合柔性蛋白質的化合物。
主要內容
1.?使用一個晶體結構代表一種配體-蛋白復合物的COMBINE分析
為了評價COMBINE分析中納入蛋白質柔性的有用性，作者使用來自X射線晶體學的一個能量最小化結構來表示每個配體-蛋白質復合物并獲得相互作用能。作者計算了訓練集中22種 p38 MAP 激酶抑制劑中每一種抑制劑與348個殘基的348個靜電和 348個范德華相互作用能。然后選擇標準偏差大于指定截斷值（0.25 kcal/mol）的相互作用能，以去除可能對koff值差異沒有貢獻的能量項，最終選擇了36個范德華相互作用能和14個靜電相互作用能。接下來，使用 PLS回歸確定這50個相互作用能量對于不同數量的潛在變量的權重，以將相互作用能量與實驗 log koff 值相關聯（圖1A）。選擇具有兩個潛在變量的模型是因為它在使用留一法（leave-one-out）進行交叉驗證時呈現最高的Q2值 0.75。此外，對于所使用的不同交叉驗證方法，Q2、AAEv 和RMEv 值相似，表明具有兩個潛在變量的模型是一致的。當從留一法轉向留二法和留三法時，Q2的下降是預料之中的，因為后者的訓練集中使用的結構較少。最終該模型的決定系數R2tr值為 0.86，表明它可以成功擬合訓練集（圖1B）。測試集的決定系數 (R2te) 為0.79（圖1B），表明該模型具有較高的預測能力。權重最高的相互作用能是抑制劑與Lys53、Arg70、Glu71和Leu167殘基的范德華相互作用能，以及與結合位點周圍的Lys53和Glu71殘基的靜電相互作用能（圖 1A、C）。與Lys53靜電相互作用的權重為負，這意味著與該殘基的有利相互作用將導致高koff值。另一方面，與Glu71的靜電相互作用和大多數范德華相互作用的權重為正，表明與這些殘基的有利相互作用將導致低koff值。
圖 1. COMBINE分析模型計算 p38 MAP激酶抑制劑的koff值。圖片來源于JCIM
2.?使用來自MD的多個結構來表示一種配體-蛋白質復合物的COMBINE分析
從p38 MAP MD模擬軌跡中挑選了10個構象，然后將33種p38 MAP激酶抑制劑與10個構象依次進行對接，總共獲得330種配體-蛋白質復合物。對于大多數配體，從集成對接中獲得的配體構象相似，并且在COMBINE模型中使用的復合物中的配體構象具有較低的RMSD值。將這些不同的結合構象同樣進行能量計算和回歸分析（圖1B）, 結果不僅包括了使用單一結構確定的一些主要貢獻，例如與Lys53 和Glu71的靜電相互作用以及與Glu71和Leu167 的范德華相互作用，而且還發現了與DFG基序中殘基 Arg67和Asp168 相互作用的突出貢獻，它們在 MD 模擬期間更接近結合位點，并且與配體的長時間駐留密切相關（圖2）。
圖2. 在COMBINE分析中使用多個結構進而考慮蛋白質和配體的柔性有助于突出與殘基Arg67和Asp168相互作用的貢獻。圖片來自JCIM
3.?使用單個或多個結構的模型比較
使用一個或多個結構從COMBINE分析中獲得了類似的R2tr 值（分別為0.86和0.83），表明兩種模型基本上都可以很好地擬合訓練集。兩種模型還可以重現由配體13（訓練集）和3、14（測試集）組成的小配體系列的排名，它們僅相差一個基團（圖3）。然而，使用一個結構的模型的整體R2te值較高，表明在具有一個結構的模型中選擇的相互作用能組具有更高的預測能力。在多個結構模型中，選擇的相互作用能的預測能力較低的可能原因包括較差的信噪比、重要蛋白質構象的采樣不足以及對接獲得的配體位置不佳等。
盡管與具有單一結構的模型相比計算時間有所增加，但對一個復合物使用多結構的 COMBINE 分析在蛋白柔性不可忽視的情況下非常有用。在這里，p38 MAP 激酶中靠近結合位點的區域在所有晶體結構中都沒有解析出來，這表明該區域是高度靈活的。使用多結構COMBINE分析有助于揭示更多參與 koff 值調節的殘基。多結構COMBINE也可應用于配體具有多種結合模式或蛋白口袋內殘基具有多種構象或旋轉異構體的情況。
圖3. 通過COMBINE分析計算的p38 MAP激酶抑制劑koff值可以重現由配體 13（訓練集）和3和14（測試集）的排名。圖片來自JCIM
小結
本文提出了一種將蛋白質和配體柔性納入COMBINE分析的方法，該方法使用來自描述一個配體-蛋白質復合物的多個結構來預測koff值。作者獲得了具有良好預測能力的p38 MAP激酶抑制劑的koff值模型，并確定了導致結合動力學變化的關鍵配體-蛋白質相互作用。此外，配體-蛋白質柔性的加入有助于突出與長停留時間相關的更多殘基，這些特定的相互作用能有助于深入了解慢速解離抑制劑和快速解離抑制劑的作用機制。
參考文獻
Nunes-Alves A, Ormersbach F, Wade RC. Prediction of the Drug-Target Binding Kinetics for Flexible Proteins by Comparative Binding Energy Analysis. J Chem Inf Model. 2021 Jul 26.