NIH開發了第一個可加速發現βGUS(β-葡萄糖醛酸酶)抑制劑的虛擬高通量藥物篩選平臺，可開發潛在的輔助治療藥物的靶點，進而減少與一線抗癌藥物相關的SAEs(嚴重副作用)的頻率。
背景介紹
對癌癥而言，藥物干預可能是治療補救的第一線。由于先天和適應性免疫細胞的高復制率，癌癥治療過程中細胞凋亡出現的表型可能包括惡心和嘔吐、食欲不振、脫發，以及發展為免疫損害狀態。由于患者試圖避免這些嚴重副作用，因此抗癌治療的不依從性很高。這個問題說明需要關注新的治療策略，即可以抑制這些脫靶效應，從而通過減少劑量限制毒性來提高抗癌藥物的治療指數的方案。
腸道內抗癌藥物，通過尿苷5 -二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UGT)介導的肝臟代謝生成無毒藥物-葡糖醛酸苷。反過來，共生腸道菌群中的β-葡糖醛酸酶(GUS)作用于藥物葡糖醛酸苷，切割其糖部分進行營養補給，在脆弱的腸細胞存在下釋放重新激活的藥物分子。因此，在脆弱的腸細胞存在的情況下，微生物依賴的小分子抗癌藥物的活化，可能是胃腸道(GI)嚴重不良事件(SAEs)的原因。
之前的研究中，研究者發現一種抑制βGUS的前藥可能會提高一線抗癌藥物的安全性和耐受性。這項研究的結果表明，提供能夠阻斷βGUS的治療輔助制劑可能會減輕與小分子抗癌治療相關的患者SAEs的負擔。由于這種調節可能產生類似于或潛在地增強抗癌治療的SAEs，因此，一種僅影響βGUS的精確抑制同時保持人類微生物組有益活性的策略，對該領域的藥物開發至關重要。
虛擬高通量藥物篩選(vHTS)是一種高效的靶向藥物發現方法，它可以模擬藥物與特定靶點的結合模式，通過預測結合能來推斷藥物療效。當靶標和結合位點明確時，可以降低大量的材料和人工成本。
主要內容
美國國家衛生研究院的Anup P. Challa?& Min Shen等人報道了通過基于結構的虛擬高通量篩選(vHTS)發現新的βGUS抑制劑的工作。研究者基于構建的βGUS同源模型，對美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)國家轉化科學推進中心化學庫中的近40萬種化合物進行了vHTS。從虛篩結果中通過多因素優先排序程序篩選出了291個化合物，獲得了69個在體外βGUS生化檢測中表現出陽性抑制活性的化合物。相關的研究成果以“Virtual Screening for the Discovery of Microbiome β-Glucuronidase Inhibitors to Alleviate Cancer Drug Toxicity”為題發布在國際著名期刊JCIM上。
βGUS同源模型的結構分析
研究者將vHTS的工作重點放在“H11G11-BG”上，這是一個具有代表性的βGUS同源物，涉及瑞戈非尼-葡醛酸的加工過程，它是酪氨酸激酶抑制劑瑞戈非尼的葡醛酸代謝物，用于治療轉移性結直腸癌、肝細胞癌和胃腸道間質腫瘤。圖1為用H11G11-BG生成的MOE和I-TASSER同源模型，并顯示了這些模型在結構上的異同。
圖1. 利用MOE和I-TASSER構建的βGUS的同源模型。圖片來自JCIM
已知βGUS抑制劑的對接分析
研究者觀察到MOE對接分數最低的化合物是磺化葡萄糖分子；但是考慮到該化合物與βGUS底物非常相似，并且在βGUS活性位點周圍具有較小的表面積，研究者決定在選擇模板結合模式時，探測表面積更大、結合能差略高的化合物。將該配體重新對接到研究者的全息靶結構上，并使用MOE的Protonate3D功能來獲得所有具有可旋轉鍵的靶點殘基的最小空間阻礙構象，從而捕獲了最終的結合姿勢（圖2）作為vHTS的模板。
圖2. ?GUS與1-((6,8-二甲基-2-氧-1,2-二氫喹啉-3-基)甲基)-1-(2-羥乙基)-3-(4-羥基苯基)硫脲結合的純模板。圖片來自JCIM
從對接分析中，研究者確定的關鍵殘基包括：
1. Glu464(允許H鍵和親核攻擊，取決于靶標配體集合的環境pH值。)
2. Tyr433(考慮到苯環在該殘基和模板抑制劑中的相對位置，如果Tyr R基團旋轉使其苯環平行于候選苯環，則通過π -π堆積實現π -π穩定是可能的。)
3. Tyr437(允許通過與殘基的自由羥基的H鍵穩定靶配體組裝。)
4. Lys563(允許通過H鍵與帶電的R基團穩定靶配體組裝。)
5. Arg564(允許靶配體通過H鍵與帶電荷的R基團穩定。)
6. Phe448(似乎在βGUS載脂蛋白構型中對抑制劑的結合提供了空間位阻，但與底物的結合促進了其逆行運動，因此這種構型的改變使配體能夠訪問位于靶點活性位點附近的抑制劑結合位點。)
圖3.發現?GUS抑制劑的工作流程。圖片來自JCIM
通過vHTS發現新型抑制劑及其結合模式
研究者在去除冗余位點和具有潛在不良功能的混雜化合物、細胞毒性化合物和PAINS motif后，選擇了1000個經過篩選的化合物進行了多參數評估。對這1000個化合物進行了結構聚類，并對所有聚類和單分子的結合模型進行了目視檢查。最后，根據預測的結合模型、排序分數、代表性結構簇和待測化合物的庫存可用性，篩選出291個化合物。
作者為這291個化合物編譯了一個結構文件庫，將它們導入到MOE中重新對接研究者的同源模型，以確保它們保持在創建vHTS網格盒時指定的關鍵相互作用。在此過程中，研究者注意到優先命中位點與他們在βGUS活性位點中發現的關鍵穩定和親核殘基相互作用一致，一些Top化合物包含多個六元環。
在分析生化vHTS命中驗證試驗的結果中，研究者在291個vHTS命中中確定了69個被確認為有效(即CC≠4和CC < 0)的分子，命中率為24%。在這些強效化合物中，研究者觀察到很少有單分子靶點。此外，發現了13個活性強的化合物，其活性被初步定義為未來探針開發的高質量活性物質(即IC50?< 10 μM，有效性< -50%)。對接流程如圖3所示。
圖4. vHTS得到的代表性化合物，包括RUC-2i(面板A)和5-(2,3-二氯苯基)-N-(3-(惡唑啉[4,5- B]吡啶-2-基)苯基)呋喃-2-甲酰胺(面板B)。圖片來自JCIM
在圖4中，研究者展示了top3命中化合物的結構、結合模式和劑量反應行為。通過對接實驗，研究者注意到在選擇抑制劑模板時，這些化合物之間的結合模式符合研究者的核心標準，這是對該方法有效性的概念的初步證明，也是對該結果有效性的進一步“完整性檢查”。
NCGC00253873是研究結果中最有效的化學系列的代表性化合物，當研究者將它與I-TASSER同源模型重新對接時，重現了“約束”殘基之間的關鍵相互作用。結果表明，生理相關βGUS菌株的IC50?= 3.8 μM，有效率= – 71%，CC = – 1.2，且具有清晰的邏輯量效曲線。
第二高的NCGC00099510對βGUS的IC50?= 9.6 μM，具有邏輯量效行為，CC =?1.2，有效性=?50%。第三高的NCGC00411059也表現出邏輯量效行為，IC50?= 11.1 μM，有效性= -72%，CC = -2.2。
在虛擬篩選加上生化βGUS試驗這個工作流程中觀察到的復合療效是強大的。與僅通過體外平臺測試NCATS化學庫相比，大大縮小篩查的規模，這表明這些結果可能比標準的HTS工作流程更明確。此外，通過對化合物活性的新觀察表明：vHTS具有從高通量藥物發現平臺挽救“假陰性”從而提高其敏感性方面的能力。
總結
本文展示了一個整體的、多層次的嘗試，研究者試圖通過vHTS的強大方法和下游生化分析體外驗證來系統地發現βGUS抑制劑。通過對約40萬個化合物的分析結果表明，這種方法是成功的，因為與標準的實驗性HTS藥物篩選計劃相比，成功率提高了23倍。該工作流程未來可用于藥物再利用，充分挖掘這類藥物在治療凝血障礙方面的潛在應用。
參考文獻
Challa, Anup P., et al. “Virtual Screening for the Discovery of Microbiome β-Glucuronidase Inhibitors to Alleviate Cancer Drug Toxicity.”?s: J. Chem. Inf. Model. 2022, 62, 1783?1793 DOI: 10.1021/acs.jcim.1c01414