介紹
甲基硫代腺苷磷酸化酶(MTAP)基因位于CDKN2A腫瘤抑制劑附近，在大約15%的癌癥中與CDKN2A共編碼，從而導致腫瘤治療效果降低，但目前沒有有效的分子靶向治療方法。MAT2A在腫瘤的代謝和表觀遺傳學中具有重要作用，它會產生甲基供體S-腺苷酸蛋氨酸(SAM)。最近的研究表明，使用RNA干擾消耗MAT2A會導致因MTAP缺失導致的癌癥得到治療。對此的解釋為：PRMT5的活性受到MTA的抑制，PRMT5酶的催化活性降低，并且它很容易因SAM水平的降低而被進一步抑制。盡管靶向MAT2A對由MTAP缺失的引起的癌癥中是有益的，但設計有效MAT2A抑制劑一直具有挑戰性。本文介紹了AG-270的藥物發現，AG-270是目前臨床開發中的一種口服的生物利用度高的MAT2A抑制劑。此類MAT2A抑制劑具有變構作用，底物不具有競爭性，并通過阻斷產物釋放來抑制MAT2A活性。此外本文還報告了臨床前研究的結果，描述了這類抑制劑的體外和體內特性。
結果與討論
1. 通過片段篩選發現MAT2A抑制劑
使用質譜超濾分析篩選了一個> 2000個片段的數據庫以結合MAT2A蛋白二聚體。最終鑒定出31個片段，命中率為1.55％，隨后在正交酶法中進行了驗證并進行SPR分析。在這些片段中，化合物1在620μM下對MAT2A表現出弱的酶抑制作用(圖1A)，這與弱的SPR傳感圖一致(圖1B)。進行了命中擴增相似性搜索，并購買了54種市售化合物并測試了MAT2A的酶促抑制作用，然后進行了SPR結合。在虛擬命中中，有2種被確定為最有效的MAT2A抑制劑(圖1A)，IC50為1.5μM，顯示出良好的劑量依賴性SPR信號，解離常數為70μM(圖1B)。使用化合物2進行的動力學顯示了針對ATP和L-蛋氨酸的非競爭性抑制方式，表明結合位點位于催化活性位點之外(圖1C)。?
圖1.?MAT2A的命中與識別
圖片來源于JMC
2. 基于結構設計產生有效的MTAP-Null選擇性的MAT2A抑制劑AGI-24512
結構分析表明，大部分疏水殘基占據化合物2的R1和R2取代基周圍結合位點的區域。在R1和R2位置形成靶向取代基，從而產生初始SAR(圖2和圖3)。R2基團的初步探索集中在探查R2結合口袋的性質。使用一種HCT116 MTAP的細胞分析法，通過測量濃度越來越高的更有效化合物處理后MAT2A產物SAM的豐度，來評估癌細胞中MAT2A的抑制作用。結構分析還可評估抑制劑結合對MAT2A活性位點的影響?；钚晕稽c具有環狀α-螺旋環結構，該結構覆蓋了活性位點的入口并在SAM結合時關閉。在所有與抑制劑結合的MAT2A共晶體結構中，均在活性位點觀察到SAM，并且在閉合位置保留。該先導化合物AGI-24512在細胞分析中得到了充分表征，并成為重要的體外工具，使進一步的細胞研究能夠評估MAT2A生物學性質。研究結果表明AGI-24512處理后MAT2A蛋白的上調。該途徑反饋機制并未阻止AGI-24512的抗增殖活性。MTAP無效基因型癌細胞生長的這種藥理學選擇性降低證實了我們先前針對MAT2A的遺傳工具的觀察結果，表明對MAT2A酶功能的藥理學抑制是一種可行的治療方法。
圖2.?化合物2與MAT2A和反應產物SAM(PDB代碼7KCE)的共晶結構
圖片來源于JMC
?
圖3. MAT2A-SAM-AGI-24512的共晶結構
圖片來源于JMC
?
3. 主要候選藥物AGI-25696的發現
對AGI-24512藥代動力學特性的初步評估，在此階段，所有化合物在臨床前物種和人微粒體中均顯示出快速的氧化代謝，因此重點在于改善代謝穩定性。首先在R3位置生成包含其他氫鍵受體的類似物，以研究其維持酶效能同時改善其代謝穩定性的能力。盡管大多數化合物都顯示出良好的酶促作用，但只有在R1處摻有苯基取代基的AGI-25696才能產生非常穩定的類似物，該首個代謝穩定的類似物在150 nM時表現出良好的細胞活性(圖4)，并在體內進行了進一步的分析。
圖4.?用體內工具分子對MAT2A進行藥理靶向可選擇性地阻斷體內無MTAP的腫瘤的生長
圖片來源于JMC
4. 臨床候選藥物AG-270的發現
?AGI-25696的PPB很高，而在Caco-2分析中卻有很高的流出比(圖4)，據推測，這種化學型的弱酸性性質是由圖5中描述的互變異構驅動的，有助于高血漿蛋白結合。由于酸性質子可以位于三個不同的位置，因此可引起與血漿蛋白結合的各種模式。
圖5. 互變異構體對物理化學性質負責嗎？假設：AC的三種可能的互變異構體在支架的不同位置共享酸性質子，這可能會增加每種化合物與血漿蛋白結合的能力
圖片來源于JMC
5. 核心的N-甲基化雖可降低PPB，但也會降低最大抑制百分比
消除了酸性質子并阻斷了互變異構的N甲基化類似物如表1所示，但是，類似物28和29顯示MAT2A的最大抑制百分比從> 90％降低到了< 70％。在其他R5類似物中也觀察到了這種趨勢，因此，這種提高游離分數的策略在維持抑制劑的全部功效方面并不成功。在整個發現程序中，酶促變構抑制作用IC50與72小時細胞分析EC50的相關性很好，但與最大抑制百分率的相關性不強。
表1.?N-甲基化改善PPB自由分數
表格來源于JMC
6. 通過分子內氫鍵掩蔽核心N- H可提高最大抑制百分比，但會影響其他ADME參數
確定了該類似物與MAT2A(MAT2A-SAM-34)的共晶結構(圖6A)，分辨率為1.24?。注意到殘基Gln190的酰胺羰基與R4處的NH，Ile332的主鏈羰基與R4的吡唑的氫以及R4吡唑的sp2(芳族)氮與分子之間的分子內氫鍵之間存在新的相互作用。然后假設該分子內氫鍵負責通過掩蓋酸性氫來改善最大抑制作用并降低PPB(表2)。該策略成為一種對抑制劑具有更大抑制作用且比N-甲基化程度更低的人PPB的更可行方法。在藥物化學中已經采用了類似的內部氫鍵策略來掩蓋極性，并已被用來改善多種結構類別的某些物理化學參數。在R3上帶有4-羥苯基的類似物顯示出低納摩爾酶促效能和高百分比最大抑制作用(表3)。該化合物(MAT2A-SAM-35)的共晶體結構以1.24?的分辨率測定，證實了預期的結合模式（圖6B）。此外，在34和AGI-24512的晶體結構中觀察到的所有相互作用在35中都繼續保持，驗證了對MAT2A抑制劑相互作用的累積結構理解。合成了35個類似物，在改變了R1和R3的同時將氨基吡唑取代基保持在R4上(表3)。這些先進化合物的表征包括細胞測定，該測定在72小時內測量了MTAP無細胞中SAM的產生，以解釋MAT2A上調以及細胞增殖測定。還測量了微粒體穩定性和PPB。
圖6.?分子內氫鍵可提高最大抑制百分數
圖片來源于JMC
?
表2.?R4基團的探索
表格來源于JMC
?
表3.?進一步R4探索提高了細胞效能
圖片來源于JMC
7. 掩蓋核心N- H并減少氫鍵供體的數量產生AG-270
在R4處進行進一步修飾可在內部氫鍵成功掩蓋極性。掩蓋極性和減少氫鍵供體的數量需要同時進行。效能和類藥性綜合最佳的化合物是AG-270，將R4處的2-吡啶與R1處的環己烯結合在一起。AG-270的測得pKa為8.56，大大高于AGI-25696的測得pKa 6.3。通過來自R4取代基的2-吡啶的分子內相互作用掩蓋酸性氫(pKa ＝ 6.3)的影響是使互變異構體穩定至大部分所需的互變異構體，其中氫保留在R5的核心氮上。這在酶和細胞分析中均具有良好的效能，同時將游離級分提高至1.54％(表4)。以1.32?的分辨率確定MAT2A·SAM·AG-270的共晶體結構，并確認了設計模式(圖7)。維持了在35的共晶結構中看到的預期相互作用，并驗證了內部氫鍵，表明結合的構象是AG-270的低能構象體。根據所使用的方法，對該生物活性構象進行的能量計算證實其處于全局最小值或接近全局最小值。此外對AG-270的ADME特性，體外輔助藥理學和口服生物利用度進行了進一步表征，AG-270的特性總體上是令人滿意的，因此AG-270的總體優越性能使其成為詳細體內分析的選擇(表5)。
圖7.?AG-270與MAT2A的共晶結構(PDB代碼7KCC)
圖片來源于JMC
??
表4.?最終R4探索生成具有平衡性質的化合物
表格來源于JMC
表5.?AG-270的特性
表格來源于JMC
結論
對癌細胞中MTAP丟失的研究表明，MTA積累使MAT2A和SAM的生產對酶PRMT5具有依賴性。然而，現有的PRMT5的臨床階段抑制劑無法解決這種MTAP依賴性作用，可能是因為現有的抑制劑具有與MTA21不同的SAM非競爭機制，因此不能選擇性抑制MTAP-null的增殖。相反，MTAP-WT癌細胞可通過MAT2A抑制作用降低SAM水平并提升MTA協同作用，從而選擇性抑制MTAP缺失細胞中的PRMT5，從而抑制細胞生長。因此，通過限制SAM，抑制MAT2A可以選擇性抑制MTAP無效的癌細胞和腫瘤中PRMT5的活性，限制PRMT5抑制作用的潛在毒性比已知的PRMT5抑制劑具有更大的治療前前景。本文描述了通過結構導向設計發現MAT2A的有效和選擇性抑制劑的過程。此外，證明了MAT2A的抑制作用可抑制體內MTAP缺失的癌癥的生長，從而驗證了MAT2A作為治療靶點的意義。
參考文獻
1. Zenon Konteatis, Jeremy Travins, Stefan Gross, et al, Discovery of AG-270, a First-in-Class Oral MAT2A Inhibitor for the Treatment of Tumors with Homozygous MTAP Deletion, J. Med. Chem., 2021, 64, 8, 4430-4449. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.0c01895.
2. Peter Kalev, Marc L. Hyer, Stefan Gross, et al, MAT2A inhibition blocks the growth of MTAP-deleted cancer cells by reducing PRMT5-dependent mRNA splicing and inducing DNA damage, Cancer Cell, 2021, 39, 2, 209-224. DOI: 10.1016/j.ccell.2020.12.010.