JMC | 計算輔助的輝瑞臨床2期TYK2抑制劑的研發過程

研究內容

JAK蛋白家族包括JAK1、JAK2、JAK3以及TYK2，它們在結構上都有JAK同源結構域(JAK homology domain，JH)，其中JH1結構域也稱為激酶區。由于四種JAK亞型的高度同源性，開發TYK2選擇性抑制劑具有很大的挑戰性。所以目前批準上市的口服JAK激酶抑制劑，如托法替尼（圖1）對TYK2都沒有高度的特異性。

圖1. 已上市或處于臨床研究的JAK激酶抑制劑結構

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在檢查四個JAK激酶的JH1-ATP位點時，發現TYR2的門控殘基為Ile960，不同于其他三個JAK家族的纈氨酸，這種獨特的氨基酸差異為合理設計TYK2抑制劑奠定了基礎。圖1中的JAK激酶抑制劑的嘧啶并吡咯基團與Glu979和Val981形成氫鍵作用時，會與Ile960的側鏈發生空間碰撞（如圖2a所示）。這在一定程度上解釋了為什么化合物1、2和3與JAK1相比，TYK2的效價分別降低了30倍、20倍和5倍。設計一個不與Glu969的羰基相互作用的鉸鏈結合基團可以解決與TYK2 Ile960的沖突。但為了彌補TYK2的效價，作者提出了一種[5,6]-稠環鉸鏈結構，可以與Val981形成新的氫鍵作用（圖2b）。這種設計策略在先前TYK2/JAK1雙重抑制劑PF-06700841的開發中也得到了應用。

圖2. (a)兩種不同的TYK2鉸鏈結合模式。(b)選擇性TYK2 抑制劑鉸鏈基序的設計策略

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芳環C?H極化以增加氫鍵電位被認為是實現TYK2活性和位點結合的必要條件。為此，基于先前已知的鉸鏈基序設計合成了幾種[5,6]-綢合芳香族體系。最初藥物的構效關系模型，使用甲基吡唑部分作為溶劑前基，類似于PF-06700841；后來為了接合到P-LooP區域，采用了取代的三氟乙基氮雜環吡唑基團。作者以化合物8（IC50=290nm）芳環 C?H的靜電電位，作為氫鍵供體能力的相對度量（圖3）。向五元環的任一位置添加氮原子以適度增加C?H靜電勢，設計合成了化合物9和10。然而，化合物9僅為中等活性的TYK2抑制劑（IC50=476nm），化合物10則對TYK2無活性，IC50>10um。作者通過分析發現，在這兩種情況下，增加的N原子不僅使得C7?H的靜電勢增加了，而且在五元環的2或3個位都增加了正電位（～50 kJ/mol）。由于這些位置朝向親脂性的門控殘基，增加這個區域的極性可能導致了TYK2的效力降低。另外，化合物10的2位氮也可能與Glu979的羰基氧發生碰撞，導致TYK2活性完全喪失。?

圖3.?用Hartree?Fock 6-31G計算的[5,6]-稠環芳香族TYK2先導化合物（8?11）的結構和靜電勢圖

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基于上述結果，作者開始轉向六元環系統的修飾來提高效力。其中吡嗪并吡唑結構由于C-H極化增加了近122 kJ/mol ，引起了作者強烈的興趣。其最負的N原子也朝向了溶劑區，避免了與蛋白之間的沖突。正如作者預料，化合物11的IC50為10nm，是一種有效的TYK2酶抑制劑，其親脂性效率（LipE）為5.5。在確定了一種有效且高效的鉸鏈結合基序后，作者對先到化合物11進行下一步優化，以提高其理化性質和JAK選擇性。圖4a為TYK2與化合物11的X射線晶體結構，和作者最初預期的結合模式一致，N1和極化的C7-H均與Val981形成氫鍵。三氟甲基氮雜環丁基通過與P環作用，增強TYK2激酶的效價。?

圖4. (a)復合物11-TYK2的晶體結構（PDB ID：6X8F）。(b)復合物11-TYK2與11-JAK2（PDB ID：6X8E）的結構對比圖

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化合物11中等的LipE反映了分子的高親脂性，作者通過LipE引導氮雜環丁烷取代基的優化，提高效價和降低脂水分配系數，改善代謝穩定性。由于三氟乙氨基化合物與潛在代謝物的睪丸毒性相關，作者優選對其進行替換，設計合成了圖5所示的一系列分子。結果顯示，試圖用環丙烷類似物來替換三氟基團無法提高效價。作者進一步嘗試引入極性以降低清除率，同時保留三氟基團提供的TYK2效價，結果也是喜憂參半?；衔?4中引入氮雜環丁胺可降低脂水分配系數，使人肝微粒體清除率（HLM）達到所需范圍，但也導致藥效顯著下降。這可能是由于酰胺導致氮雜環丁烷變平，可能不允許乙?；苯优cP-loop結合。在該系列中，化合物16重現了化合物11的效價，也降低了HLM清除率，并將LipE提高到6.7?；衔?6對JAK3和JAK1具有良好的選擇性，但對JAK2的選擇性只有5倍。

為了進一步了解JAK2選擇性，作者獲得了復合物JAK2與化合物11的X射線晶體結構，并與TYK2結構進行比較（圖4b）。疊合JAK2和TYK2的蛋白結構，JAK2的P環相對TYK2略有升高。兩種結構的疊加和電子密度顯示化合物11相似的結合模式。據報道，與P-環的細微相互作用差異會影響其他JAK抑制劑的選擇性。而在這個疊合的結構圖中發現的唯一微小差異是氮雜環的結構。在JAK2結構中，氮雜環丁烷采用了一種“反式”結構，將末端-CF3基團朝向P-環。相比之下，TYK2氮雜環丁烷構型采用了“順式”構型。根據所觀察到的結果作者提出一個假設，即固定四元環構型可以用來提高選擇性，環丁烷可以達到這個目標。作者制備了甲氧基環丁烷非對映體cis-17和trans-18，均保留了TYK2的效價（16和22nm），并且trans-18對JAK1（68倍）和JAK2（10倍）具有較高的選擇性，與預期的一樣，甲氧基環丁烷類似物的LogD增加。出乎意料的是，cis-17和trans-18的HLM清除率相差很大。兩個非對映體順/反異構體除了效價和選擇性上的差異外，在清除率方面也表現出了有益的差異。其他設計合成的非對映異構體也表現出類似的概況。

圖5.?氮雜環丁烷取代基的構效關系研究

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為了更好地理解環丁烷類似物與TYK2的相互作用，作者解析了復合物TYK2與22的X射線晶體結構。順式環丁腈部分位于P-環的下方并朝向其頂端（圖6a）。P環末端主要含有疏水殘基和一個氫鍵網絡，在模擬apo態蛋白時，此區域的水分子很不穩定（高能水分子），通過結構疊合可以看到預測的高能水被22的環丁腈取代，同時口袋的靜電圖也顯示了正的靜電勢，可以提供與氰基的良好相互作用。根據TYK2的效價、JAK選擇性和低清除率，作者選擇化合物22進一步研究吡唑基（R2）的藥物的構效關系。同時，還對活性更強但JAK1選擇性較低的trans-21進行了探索，以期望提高TYK2的選擇性。假定吡唑上暴露的甲基具有低效的親油性（圖6b），去除甲基之后，效果并沒有得到改善。為了提高NH-吡唑的滲透性，1H-3-吡唑允許互變異構體將N-H朝向核心氮，并通過分子間氫鍵屏蔽H-鍵供體，最后合成了1-甲基-3-吡唑類似物。作者選擇了一組TYK2高效價和低體外代謝清除率（HLM<（8μL/min/mg蛋白質）的化合物，進行人類全血（HWB）細胞因子的分析，建立這些分析是為了確定關于療效和非靶點效應的理想候選特征。最終一系列細胞和動物實驗表明，化合物22（PF-06826647）表現出最理想的效果，被選為選擇性的TYK2抑制劑進行臨床研究。

圖6. (a)復合物22-TYK2的晶體結構的口袋靜電勢圖（PDB ID：6X8G）。(b)化合物22與TYK2的結合模式，并標注了小分子與Val98的兩點關鍵相互作用

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結論

本文講述了輝瑞公司通過鑒定和優化一系列與JH1結構域ATP位點結合的TYK2抑制劑，發現了具有細胞和體內活性的小分子抑制劑。首先，基于結構特征和靜電勢模型確定了激酶鉸鏈核心結構，提供了TYK2的效力，并且從一開始就對其他JAK家族成員表現出令人鼓舞的體外選擇性。通過設計環丁烷類似物進一步優化，使之與P環結合，進一步提高TYK2的選擇性以及平衡物理化學性質保證了該系列的高滲透性和低代謝清除率。通過在人全血檢測中篩選、直接測定細胞因子信號，確定了JAK2選擇性的平衡水平，揭示了JAK2和TYK2的復雜異二聚體伙伴關系。平衡地抑制TYK2和JAK2可促進IL-12和IL-23的抑制，同時維持重組人促紅素抑制在合理范圍內。經過這一系列的努力研發出了化合物22（PF-06826647），該化合物已經完成了健康受試者的一期臨床實驗，正在進行斑塊狀銀屑病患者（NCT03210961）以及多個炎癥性疾病適應癥的二期臨床研究中。

參考文獻

Brian S Gerstenberger et al. Discovery ofTyrosine Kinase 2 (TYK2) Inhibitor (PF- 068266 47) for the Treatment ofAutoimmune Diseases. J. Med. Chem.(2020).