JMC | 如何針對高度保守的結合位點設計高選擇性配體？N-肉豆蔻?；D移酶的案例研究

藥物設計的一個主要目標是針對特定靶標獲得高親和力的配體，同時保持對潛在脫靶的選擇性以減少副作用。當靶標和脫靶之間的結合位點趨于保守時，設計選擇性配體就變得困難重重，已被報道的選擇性抑制劑的潛在分子機制通常仍不清楚。N-肉豆蔻?；D移酶（NMT）催化一種共價修飾反應，將14碳飽和脂肪酸從肉豆蔻酰輔酶A上轉移到一系列真核和病毒蛋白的N-末端甘氨酸上。肉豆蔻?；谡婧松镏惺且粋€共翻譯修飾過程，并在諸如信號級聯轉導，膜泡運輸和蛋白定位等細胞進程中發揮重要作用。NMT對寄生蟲的存活和毒性至關重要，是一個非常有前景的用于抗癌和一系列寄生蟲和病毒性疾病的藥物靶標。來自原生動物寄生蟲（LmNMT）和人源HsNMT1，兩種酶序列相似度為45.4%，但具有高度保守的結合位點，僅有3個殘基不同。以該酶為研究對象，通過計算和實驗結合的方法，揭示具有保守位點的蛋白質中決定選擇性的特征并指導科學家理性設計這類蛋白的選擇性抑制劑。

從文獻中收集了8個NMT抑制劑，1-3為非選擇性配體，4-6和8為LmNMT選擇性配體，6a和7為HsNMT1選擇性配體。所有化合物都含有堿性中心與C末端相互作用但是是與具有開放結合位點的構象結合，即由于Tyr217的旋轉，化合物能夠進入主要的疏水口袋。對化合物5而言，其對LmNMT和HsNMT1的選擇性達到了約108倍，為了詳細解釋造成選擇性的原因，進行了與分子動力學模擬結合的定點突變實驗以獲得配體與LmNMT和HsNMT1結合的具體情況。配體不是與兩酶不同的三個氨基酸殘基的側鏈原子直接相互作用，因此將彼此不同的殘基相互交換即獲得具有HsNMT1結合位點的LmNMT，反之亦然。突變結果顯示1-3和4只稍微改變選擇性，化合物5的選擇性大幅下降。而僅突變一個氨基酸則使得抑制劑4選擇性大大提高。進行野生型和突變型的空蛋白結構以及與配體結合的復合物的MD模擬，所有模擬顯示蛋白質高度的穩定性，在50ns內沒有更大的構象變化。計算側鏈有序參數（S2）來量化側鏈柔性的改變。數值越低柔性越高，在所有模擬中，化合物4結合HsNMT1時，觀察到C末端殘基Gln496側鏈柔性的劇烈降低，證明4的選擇性是由側鏈柔性變化造成的并觀察到側鏈柔性變化使得配體遠離殘基?；衔?的選擇性則由結合位點內的水網絡有關，MD軌跡模擬出的水密度圖顯示水分子W1與HsNMT1的結合強于對LmNMT的結合，且5的結合需要在HsNMT1替換W1，突變后的MD模擬進一步證實了W1對于化合物5的選擇性至關重要的假設?；衔?和8的結合模式使用X-射線晶體學和MD模擬證實了針對NMT的選擇性分別由水分子的干擾和側鏈柔性的改變造成。

基于在HsNMT1中水分子W1位置導致選擇性差異的假設進行LmNMT選擇性抑制劑的基于藥效團模型的虛擬篩選。藥效團的核心特征是需要一組干擾假陽性靶標HsNMT1中的W1，位置與化合物5的C2相似，另外，添加抑制劑1-7與NMT的相互作用以獲得合理的結合親和力。接著將藥效團查詢到的分子對接到結合位點，并選擇6種化合物用于測試酶抑制能力。實驗證實了化合物篩選得到的化合物9-11具有對LmNMT的特異性和選擇性。結晶結果支持化合物的選擇性是由通過W1干擾的假設。

圖3. 用于虛擬篩選的藥效團模型

圖片來源JMC

表1. 化合物9-11在500μM的抑制百分比

表格來源JMC

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本文采用計算機輔助藥物設計和實驗結合的策略，使用分子動力學模擬，等溫滴定量熱法，酶抑制測定，定點誘變和X射線晶體學結合的方法，確定了兩種具有高度保守結合位點的不同來源的N-肉豆蔻?；D移酶的不同選擇性的決定因素并提供了可量化的指標。側鏈柔性的變化和干擾水分子都能造成選擇性的差異。并對68萬化合物庫進行虛擬篩選，通過分子對接發現了經理性設計得到的受水分子干擾的3種LmNMT選擇性抑制劑，成功將文中知識運用在了具有高度保守結合位點的蛋白的選擇性抑制劑設計中。

參考文獻：

Kersten, C.; Fleischer, E.; Kehrein, J.; Borek, C.; Jaenicke, E.; Sotriffer, C.; Brenk, R. How To Design Selective Ligands for Highly Conserved Binding Sites: A Case Study Using N-Myristoyltransferases as a Model System. Journal of medicinal chemistry 2019, 10.1021/acs.jmedchem.9b00586