引言
AZD9291也稱為奧希替尼, 是治療非小細胞肺癌（NSCLCs）的三代靶向藥，對具有T790M介導耐藥性的表皮生長因子受體(EGFR)突變的非小細胞肺癌具有高度的療效。盡管AZD9291作為“明星”產品，但由于與EGFR T790M突變激酶的結合方式尚未確定，所以關于AZD9291對T790M突變體的耐受性和優先結合機制仍不明確。在這里，作者采用分子動力學（MD）模擬，觀察到AZD9291可與T790和T790M突變體的EGFR激酶自發結合。模擬生成的結構模型表明，AZD9291與T790M的結合模式與T790不同，AZD9291與T790M中的門控殘基（Met790）形成范德華相互作用，而與T790中的Thr790沒有相互作用，這解釋了AZD9291與T790M的結合具有更高的親和力。最后實驗測定的AZD9291與EGFR T790M復合晶體結構和MD模擬生成的模型是一致，進一步驗證了MD模擬的結果的可靠性。作者認為，結合模式上看似微小的差異，可能會產生實質性的影響，因此了解AZD9291選擇性的結構基礎可能會大大有助于此類新藥的開發。
先睹為快
作者信息
北京大學基礎醫學院生物物理系云彩紅教授
David E. Shaw Research Group的單一兵教授和David E. Shaw
靶點? ?
EGFR L858R (簡稱T790)、EGFR L858R/T790M (簡稱T790M)
計算方法
分子動力學模擬（MD simulations）
計算流程
為了研究AZD9291與EGFR激酶之間的相互作用，作者對AZD9291與T790M和T790的自發結合過程進行了無偏MD模擬。MD模擬從未結合態開始，將三個AZD9291分子任意放置在模擬系統中。每個體系都平行跑了17個模型，時長均為10μs。通過對MD軌跡的分析，探究AZD9291與EGFR的相互作用特征。
AZD9291與EGFR T790M的結合機制研究
為了研究AZD9291與EGFR激酶之間的相互作用，作者對AZD9291與T790M和T790的自發結合過程進行了無偏MD模擬（圖1a）。MD模擬都是從未結合態開始，將三個AZD9291分子任意放置在模擬系統中。作者首先模擬了AZD9291與T790M的結合，在17個獨立的時長10μs模擬中，觀察到8個結合狀態（圖1d）。如圖1c, 其中有4個模擬軌跡中，AZD9291分子呈現穩定的翻轉構象（flipped），即吲哚的苯環指向門控殘基。其他4個體系，AZD9291以未翻轉的方式(un-flipped)結合，類似于之前報道的晶體結構。兩種構象的相同點在于都維持了AZD9291與Met 793的“鉸鏈”氫鍵，不同之處在于，在翻轉構象下，吲哚部分旋轉約180°，使得吲哚的苯基指向Met 790的側鏈。接著作者模擬了AZD9291與T790的結合，同樣進行17個獨立的10μs模擬，8個AZD9291分子達到了穩定的結合狀態。模擬結果顯示，在這8個結合狀態中，有7個是未翻轉的狀態（圖1c）。?
圖1. AZD9291與T790和T790M的 MD模擬結果
圖片來源于JMC
進一步分析結合過程，AZD9291首先以非翻轉構象進入結合位點，進入結合位點后，AZD9291和結合位點的構象均出現明顯波動，當AZD9291采用翻轉構象后，波動開始減弱（圖1b）。AZD9291在進入結合位點并接近Met790后，采用翻轉構象的事實表明，T790M通過與AZD9291在結合過程中相互作用來誘導翻轉姿勢。并且，翻轉構象可為自由能（~0.4 kcal mol?1）提供有利的熵貢獻。同時，作者發現AZD9291對EGFR的不同結合模式，不僅可以穩定復合物結構，還促進了共價鍵的形成。作者測量了Cys797的巰基和AZD9291彈頭之間的距離（圖2），來衡量共價鍵形成的效率，結合模式中翻轉構象中的距離明顯小于未翻轉構象(分別小于4 ? 和7 ?)，說明翻轉構象促進了共價鍵的形成，更有利于米氏復合物的形成。?
圖2. MD模擬過程中AZD9291的彈頭與Cys797（SG）的距離分布
圖片來源于JMC
最后，作者通過實驗測定EGFR T790M與AZD9291的復合晶體驗證了MD模擬生成的結構模型的可靠性。AZD9291在這種共晶結構中采用的翻轉構象與MD模擬中采用的翻轉構象相同，此時，吲哚和Met 790側鏈之間有利的范德華相互作用可能比未翻轉的姿勢更強，如圖3a所示。值得注意的是，在T790/AZD9291結構中，雖然α C-out的非活性構象在ATP結合位點產生了一個更大的口袋（相對于EGFR的α C-in活性構象），理論上很容易容納吲哚的翻轉，但AZD9291仍然保持未翻轉的結合模式（圖3b）。這一觀察結果再次表明，AZD9291的翻轉構象是由T790M中Met790側鏈與AZD9291的吲哚基團相互作用引起的。T790M/AZD9291中的EGFR激酶采用了在以前晶體結構中未觀察到的獨特構象（圖4），在這種結構中，C-螺旋是扭結的（kinked），螺旋的N-端半部分（殘基753-759）從螺旋的αC-in位移了4-7?，而其余的C-螺旋（殘基760-768）保持αC-in的位置；A-loop的部分殘基（殘基867-872）形成了一個與N-lobe密切相關的短螺旋（圖4c）。盡管具有獨特的C-螺旋構象，T790M/AZD9291的整體構象與EGFR的活性構象（圖4a，黃色）比非活性構象（圖4b，青色）更為相似。??
圖3. AZD9291在復合晶體結構中的結合模式示意圖
圖片來源于JMC
圖4. T790M/AZD9291中EGFR激酶的獨特C-螺旋構象
圖片來源于JMC
結論
在這項工作中，作者通過MD模擬和X射線晶體學共同揭示了AZD9291與EGFR激酶T790M突變體的一種先前未知的結合模式。結果可以總結為以下三點：
（i）當AZD9291與EGFR T790M結合時，與野生型EGFR（Thr 790）結合模式相AZD9291傾向于采用另一種結合構象，即吲哚旋轉約180o。
（ii）AZD9291以翻轉構象與T790M結合時，增加了化合物與Met 790之間的范德華相互作用，可能使其對T790M具有更高的親和力。
（iii）AZD9291與T790M的翻轉結合模式，使化合物的彈頭（丙烯酰胺）更接近EGFR 的Cys 797側鏈，可能促進化合物與EGFR之間共價鍵的形成。
參考文獻
Xiao-E Yan, et al. Structural Basis of AZD9291 Selectivity for EGFR T790M. J. Med. Chem.(2020).