JMC | 2-(鄰位取代芐基)-吲哚類RORγ 激動劑的設計、合成與抗腫瘤研究

背景介紹

RORγ（視黃酸受體相關孤兒受體）靶點與炎癥誘導癌癥免疫密切相關。RORγ 激動劑可以通過促進 Th17 細胞分化、激活免疫系統來治療癌癥。Th17 細胞是多種自身免疫性疾病發病機制中關鍵的炎癥效應物，通過產生保護性炎癥，促進腫瘤免疫中的細胞毒性 T 細胞活化。保留干細胞樣分子特征的 Th17 細胞甚至能有效地根除腫瘤并引起自身免疫。因此，促進 Th17 細胞分化的 RORγ 激動劑有望在多種癌癥中發揮治療作用。近年來，文獻報告了合成 RORγ 激動劑在腫瘤免疫治療中的潛在價值。其中，Lycera研發的 RORγ 激動劑 LYC-55716 是當前最佳的候選藥物，已經進入臨床1期。

主要內容

Vitae公司報告了一種口服 RORγ 抑制劑 VTP-43742，該抑制劑在銀屑病患者的 2a 期臨床試驗中顯示出陽性結果。恒瑞藥化部門的Biao Lu及其團隊基于 VTP-43742 ，使用骨架躍遷設計了一系列新型 6/5 稠環雜芳烴，其中化合物 1 顯示出有效的體外 RORγ 拮抗活性（圖 1A）。在時間分辨熒光能量轉移 (TR-FRET) 的RORγ 輔助因子測定中，化合物 1 相對于載體，與 RORγ LBD 結合導致 TR-FRET 信號降低，呈現與 VTP-34742 相似的特征（圖 1B）。與 VTP-43742 左側的飽和環己基環相比， 1 的芐基的構效關系值得進一步探索。其鄰位?CF₃– 芐基取代的2則顯示出相反的效應，促進 TR-FRET 信號增加。

圖1. RORγ激動劑的逐步演變及與RORγ LBD的輔酶因子結合方面的相反機制. 圖片來源自JMC

文獻報告它們的叔磺酰胺和酰胺系列分子的微小結構變化可能在 RORγ 受體結合域呈現不同的機制。于是作者將三氟甲基從苯環上的對位移動到鄰位，功能便從拮抗劑轉換為激動劑。接著將化合物1，2分別建模出拮抗劑和激動劑的蛋白質結構。核受體一般需要一個關鍵的氫鍵來維持激動劑構象。在 RORγ 中，這個關鍵的氫鍵位于 LBD11 的 Helix 12 的 Tyr502 和 Helix 11 的 His479 之間，如圖 2b所示?；衔?與 Leu287、Arg367 和 Phe377 形成了三個關鍵的氫鍵相互作用，如圖 2a 所示。它的間位?CF_3?苯基很好地指向了由 Helix 3 的 Phe486 和 Helix 11 的 Trp317 形成的口袋。它們將 His 479 鎖定在構象中，從而使其不能與 Tyr502 形成氫鍵。而2 的苯環鄰位?CF_3?足夠大，可以促進 His479 與 Tyr502 形成氫鍵。其余配體則與 Arg364、Arg367 和 Phe377 保持相同的三個關鍵氫鍵相互作用。?

圖2. 化合物1和2的結合模式。圖片來源自JMC

然后對化合物2進一步優化。5-羧酸甲酯作為原料，在鈀催化下通過選擇性 CH 活化，與各種芐基溴反應獲得關鍵的 2-(鄰位取代芐基)-吲哚中間體 1a-13a，然后經不同的鹵代烷烷基化，得到 N-取代的吲哚中間體 1b-15b。在堿性條件下水解后，無需進一步純化即可獲得羧酸 1c-15c。最后經縮合得到最終化合物 1-17。

SAR 結果如表 1 所示，正?E_max??表示激動作用的最大功效，負?E_max?表示拮抗作用的最大功效。化合物4作為拮抗劑，顯示出10 nM (E_max= -70%) 的?EC₅₀。芐基環衍生物 5是較弱的拮抗劑，EC₅₀=683 nM (E_max= -67%)。隨著受阻取代基的增加，6 和 7 也顯示出拮抗效應。溴代物 8 是激動劑，EC_50?是 16 nM (E_max= +79%)。此外，化合物 9、10 和 11 顯示出與激動劑相似的結合模式。可見吲哚系列的生物效應可能取決于芐基環的受阻基團。

表1. 吲哚系列分子的構效關系。圖片來源自JMC

為了確認細胞靶向活性，作者使用 PBMC 細胞研究 RORγ 激動劑對 RORγ 調節的 IL-17 分泌的影響。PBMC 經細胞刺激素刺激 72 小時，細胞培養上清液中 IL-17 的分泌增加 25 倍。這證實了 Th17 細胞分化。我們在相同的測定環境中評估了拮抗劑和激動劑。

表 1 中所有激動劑在相同的分析條件下促進了 PBMC 細胞的 IL-17 分泌，拮抗劑（例如1 和 4）可顯著抑制 IL-17 分泌。盡管10 在誘導 IL-17 分泌效果方面比2 強 4 到 5 倍，但實驗表明它是一種部分激動劑（EC₅₀= 2 nM，E_max= + 79%）。8、9 和 10?在人類和大鼠微粒體中表現出不穩定性，半衰期不足 15 分鐘。鄰位?CF_3?取代的化合物 2 顯示中等微粒體穩定性，半衰期約 40 分鐘。

12 和13可阻斷潛在苯環代謝點，提高肝微粒體穩定性，顯示出良好的激動活性。我們嘗試用其他基團取代13 吲哚 N 位的異丙基。14 顯示出相似的效果，但是在 IL-17 中活性較弱，15 顯示出更好的效力和相似的功效。

作者分別在小鼠、大鼠和狗中測定了15 的藥代動力學 (PK) 曲線，結果發現化合物 15 在小鼠中口服生物利用度 (47.3%) 有所提高，作者推測酰胺鍵的水解是主要的代謝途徑。作者合成了一對具有與酰胺鍵相鄰的羥基甲基取代基的化合物 16、17（圖 3）。17進一步提高了療效，幾乎是完全激動。16是較弱的激動劑，與 RORγ LBD 的相互作用沒有形成更有利的激動構象。17 的效果在 RORγ 調節的 IL-17 上得到了驗證。

圖3. 化合物16和17的結構式。圖片來源自JMC

此外，實驗發現17 對另一個 ROR 家族成員 RORα 具有高選擇性。與15 相比， 17 的 PK 曲線得到了顯著改善。PK 結果總結在表2中。17 具有非常低的清除率與良好的跨物種口服生物利用度。17的體內研究的實驗方案如圖5a所示。在MC38小鼠同源結直腸腫瘤模型的實驗中，與對照組相比，所有治療都具有良好的耐受性，小鼠體重幾乎沒有變化（圖 4b）。所有處理組的生長曲線如圖4c所示。

表2. 化合物17的PK效果。圖片來源自JMC

一組小鼠 (n = 3) 與其他組，一起每天口服 10 mg/kg 的17治療腫瘤。在第 5、11、18 和 25 天給藥3小時后從這些小鼠中采集血樣。如圖 4d 所示，化合物 17 的濃度逐漸累積并在第18天后達到平衡。在第25天給藥3小時后收集所有組 (n = 8) 的血漿和腫瘤，用于17 的 PK 分析（圖 4e）。17 的平均血漿濃度在10 mg/kg，組中值為 9117 ± 1006 ng/mL，在組合組具有相似的濃度 (10 787 ± 1078 ng/mL)。體內藥效研究結束時血漿樣品的結果與本研究的時間過程一致。由于17 在小鼠中的分布容積較低，因此 17 在腫瘤中的濃度低于血漿中的濃度。17 的血漿和腫瘤的暴露比在4.5和4.6之間。?

圖4. 化合物 17 單獨使用，以及與PD-1 mAb 聯用在 MC38 小鼠同源結腸腫瘤模型中的藥效。圖片來源自JMC

為了確認 17 的靶向活性，作者使用從腫瘤組織中分離的細胞（每組四只小鼠），以IL-17 作為 PD 生物標志物，研究了給藥方案與IL-17分泌的關系。結果（圖 5）表明，化合物 17 給藥方案顯著增加了 IL-17 的濃度。17與抗 PD-1 mAb 的組合提高了 IL-17 的水平。17 還可以顯著增加 IFNγ 濃度，與抗 PD-1 mAb 組合可提高 IFNγ 的水平?；衔?17 治療激活的 RORγ 受體促進了腫瘤中相關細胞因子的產生和細胞毒性 T 細胞的激活，從而更大程度上抑制了腫瘤生長。

圖5. ?PD生物標志物對化合物 17以及17與抗 PD-1 mAb 聯用的反應。圖片來源自JMC

結論總結

這是第一份通過詳細的 SAR 研究 RORγ 激動劑的工作。在 MC38 小鼠同基因結腸腫瘤模型中，除了 PD-1 免疫檢查點外，作者嘗試通過阻斷 Th17 通路的藥物聯用的方法來提升抗腫瘤藥效?；衔?17 與抗 PD-1 mAb 聯合治療在一定程度上增強了腫瘤生長抑制效果。生物標志物研究的結果和 MC38 同基因小鼠結直腸腫瘤模型的體內藥效研究表明，該組合通過抗 PD-1 mAb 阻斷免疫檢查點和通過 RORγ 阻斷 Th17 信號通路激動劑可能有助于改善臨床反應。這個方向值得進一步探索。

參考文獻

Biao Lu, Dong Liu, Bin Gui, Jun Gou, Huaide Dong, Qiyue Hu, Jun Feng, Yuchang Mao,?Xiaodong Shen, Shenglan Wang, Caihua Zhang, Ru Shen, Yinfa Yan, Lei Chen, Huiyun Wang, Di Li,?Jiayin Zhang, Minsheng Zhang, Rumin Zhang, Chang Bai, Feng He, Weikang Tao, and Suxing Liu, Discovery of 2?(Ortho-Substituted Benzyl)-Indole Derivatives as?Potent and Orally Bioavailable RORγ Agonists with Antitumor?Activity, Journal of Medicinal Chemistry, 2021, 64, 14983-14996.