JMC | 甲酰肽受體 2 (FPR2) 脲基丙酰胺類激動劑的設計、合成與生物學評價

背景介紹

中樞神經系統炎癥（CNS）會損害神經功能并導致神經退行性病變。在炎癥消退階段，專門的促消解介質 (SPM)可促進炎癥反應自發消退。SPM 通過特定的膜受體發揮作用，N-甲酰肽受體2（FPR2）是其中的一個重要靶點。FPR2是甲酰肽受體家族的成員，可以被結構不同的激動劑激活。不同的激動劑還會觸發FPR2的促炎反應或者抗炎促分解效應。

第一代小分子 FPR2 激動劑（圖 1中的compound 43 和compound 17b）在急性心肌梗死模型中顯示出不同的心臟保護特性。4-苯基吡咯烷酮類FPR2 激動劑 BMS-986235可抑制中性粒細胞趨化性并刺激巨噬細胞吞噬作用，從而改善心力衰竭小鼠模型的功能。環戊烷類化合物 1（圖 1左）在心血管炎癥的體外模型中具有抗炎特性。

作者之前開發的脲基丙酰胺類 FPR2 激動劑是化合物 2，?它在亞微摩爾濃度下具有抗炎藥效和良好的體外藥代特性，機理與脂氧素 A4 (LXA4)類似但活性太弱。作者嘗試優化分子，改善藥效和藥代特性。

圖1. 代表性的FPR2小分子激動劑(左)和設計策略(右)。圖片來源：JMC

主要內容

作者從化合物2出發合成了一系列分子，發現氟取代基可提高活性，吲哚改成芳香族殘基可顯著提高穩定性。苯基環丙基甲基片段的體積和位置對 FPR2 的活性和代謝穩定性十分重要（圖 1右）。大取代基可改善代謝穩定性，但會降低活性。為了兼顧兩者，作者用不同基團替換苯基環丙基片段。作者先引入雜環（如表1所示），確定最佳的取代基，再優化代謝穩定性。

表1. 合成化合物的活性（IC50）、誘導拮抗作用(EC50)、代謝穩定性、毒性。表格來源：JMC

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Scheme 1. 目標化合物的合成路線。圖片來源：JMC

活性和代謝穩定性分析

作者測量化合物在轉染FPR的HL-60 細胞中誘導鈣離子的能力來評估活性，記作EC50。此外，考慮到FPR1和FPR2在用激動劑刺激后，可能出現拮抗作用，作者還用 FPR標準激動劑產生的抑制作用來評估化合物在 FPR誘導拮抗作用的水平（IC50，表 1）。

與 2 相比，ε-己內酰胺衍生物 (S)-11a 的藥效增加了 20 倍，哌啶基衍生物?(S)-11b 的效力比 2 高 4 倍，而吡咯烷衍生物 (S)- 11c 與 2 等效。在這組化合物中，(S)-對映異構體比 (R)-對映異構體更有效。在雜環衍生物11d、11e、11f、11g觀察到相同的趨勢。更重要的是，所有 (S)-對映異構體的效力至少是 2 的 10 倍，其中 (S)-11e 是該組中最有效的 (EC₅₀?= 26 nM)。結果表明與酰胺相連片段的大小和手性對 FPR2 的激動效果有很大影響。

作者發現分子隨著活性提升，代謝穩定性會變差。于是作者嘗試修飾11b、11d、(R)- 11e 和11f，阻止分子氧化代謝。11b和11h在4位取代后，提升了代謝穩定性，活性降低 20 倍。11e在二氫吲哚的修飾后也出現相同情形，11e引入氮雜基團均降低了活性和代謝穩定性。與第一組化合物對比，結構修飾提高了選擇性，其中11i的選擇性達到了30倍。所有化合物都能夠有效降低鈣離子流動，IC50?總體達納摩爾級，FPR1的IC50?在微摩爾級。第二組化合物中的修飾雖然沒有提高活性，但是顯著提升了代謝穩定性。

分子模型

已發表的FPR2復合物的結構中，分子在GPCR中呈現經典的跨膜排列的姿勢，寬闊的結合口袋位于膜的上三分之一處，并對外部環境呈開放狀態。正負電荷、脂肪和芳香片段指示了口袋中的結合熱點區域。

對接方法為：以SMILES輸入，在Maestro中生成各式手性三維構象，然后用Open Babel通用力場優化。作者采用Maestro的Protein Preparation Wizard處理受體蛋白(A鏈，PDB:6OMM)，移除配體和水分子，加氫，優化坐標并加電荷。接著使用AUTODOCK對接分子構象，按照構象的最佳自由能，篩選并作為配體最佳結合模式。

先對接的分子是compound 43。結果表明4-氯脲基苯基片段與 Phe110、Trp254 和 Phe257形成堆積作用，與Asp106 和 Arg201 形成氫鍵。上半部分的苯環與His102 和 Phe178形成堆積作用，異丙基與 Leu81 和 Val105 產生范德華力（圖 2左上）。這些都是激活FPR 的重要殘基。

(S)-11e 也有相似的結合模式， 4-氟苯基環和脲基片段形成相同的相互作用，經水分子與Ser288形成作用（圖 2右上）。二氫吲哚還與 Arg201 的胍結合成電荷轉移復合物。(S)-11e與 Glu89 共同吸住一個水分子。 (R)-11e 反向構型降低了結合效率。?

圖2. 上：Compound 43（左）和(S)-11e(右)在FPR2活性位點的結合模式（PDB：6OMM）和下：2(左)和(S)-11e(右)的相互作用圖。圖片來源：JMC

小體積的二氫吲哚可以讓(S)-11e產生更多的活性構象，而環丙基迫使 2 的結合活性構象更加扭曲。因此，(S)-11e與殘基結合的時間更長，結合的構象更加多樣且牢固。該結論通過分子模擬得到了證實。在圖 2 相互作用圖中，(S)-11e和2的 4-氟苯基脲基片段能夠產生與 Leu109、Phe110 和 Phe257 的疏水相互作用，相比之下， 2 僅 70% 通過脲基片段的相互作用錨定到受體表面， 4-氰基苯基和環丙基部分不會接觸受體的其他部分。

(S)-11e 幾乎 100% 通過幾個氫鍵直接與 Asp106 結合，并通過水分子與 Arg205 結合。二氫吲哚和 4-氰基苯基環也與 His102形成π-π 堆積作用。此外，分子模擬表明構象中心到受體的距離也有顯著差異，尤其是在模擬的最后 500 ns 中：2和(S)-11e的構象到受體的平均距離為 11.10 ± 0.38 和 10.19 ± 0.26 ?。結果表明后者與受體結合得更好，如圖3所示。?

圖3. 2和(S)-11e的模擬過程中構象中心到受體的距離的變化情況（上）和對接結果（下）。圖片來源：JMC

生物學實驗

作者用N9 細胞MTT測定細胞毒性。結果顯示11a、11b、11c、11h無細胞毒性，其余化合物僅在微摩爾濃度下具有細胞毒性。作者使用LPS（革蘭氏陰性菌細胞壁內毒素）誘導細胞內產生炎癥，以評估藥物阻斷炎癥的效果和細胞毒性作用。在靜息條件下，除了化合物(S)-11g和(R)-11l之外，其余化合物對細胞活力沒有顯著影響。

接著評估藥物對促炎介質 IL-1β 和 TNF- α分泌的影響。結果表明化合物 (S)-11a、(S)-11e、(S)-11i 和 (S)-11l 能夠有效減少 LPS 誘導的細胞因子產生，表現出抗炎特性。

除此之外，評估了(S)-11e和(S)-11l在靜息條件下和用 LPS 刺激 24 小時后對細胞活力和一氧化氮產生的影響。兩種化合物在靜息條件下均未對細胞活力或 NO 產生任何影響，這證實它們沒有促炎作用。

作者還評估了(S)-11e 和 (S)-11l對線粒體膜電位和對半胱天冬酶 3 活性的抑制作用，發現LPS可以顯著降低膠質細胞線粒體膜電位。而用 (S)-11e 或 (S)-11l 預處理可使 LPS 刺激 24小時后的線粒體膜電位正?；?。作者發現 LPS 刺激還可促進促炎介質釋放加速細胞凋亡， (S)-11e和(S)-11l 預處理細胞可顯著緩解凋亡。這表明兩種化合物都具有神經保護、抗炎和促分解作用。

選取(S)-11l做體內藥代動力學實驗。腹膜內注射后，(S)-11l較快到達體循環，給藥后30 min血藥濃度最高，在血漿給藥后 8 小時。大腦采樣證實?(S)-11l能夠滲透血腦屏障并在腦中蓄積。

結論

為了研發具有更好藥代性質的FPR2激動劑，作者通過合成及計算方法得到了一組高效且代謝穩定的化合物。一系列生物學實驗表明這些化合物具有抗炎作用并可穿透血腦屏障。

參考文獻

Margherita Mastromarino, Maria Favia, Igor A. Schepetkin, Lylia N. Kirpotina, Ewa Trojan, Mauro Niso, Antonio Carrieri, Monika Leskiewicz, Magdalena Regulska, Massimiliano Darida, Francesco Rossignolo, ?Stefano Fontana, Mark T. Quinn, Agnieszka Basta-Kaim, Marcello Leopoldo, and Enza Lacivita. Design, Synthesis, Biological Evaluation, and Computational Studies of Novel Ureidopropanamides as Formyl Peptide Receptor 2 (FPR2) Agonists to Target the Resolution of Inflammation in Central Nervous System Disorders, 2022, XXXX, XXX, XXX-XXX