Syros制藥公司基于晶體結構，結合動力學模擬、ADME等分析發現了一種高選擇性的CDK7非共價抑制劑。目前SY-5609正在進行臨床一期試驗。
背景介紹
細胞周期蛋白依賴性激酶7 （CDK7）是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，在細胞周期的轉錄和調節中發揮關鍵作用，對腫瘤的擴增轉錄和異常生長特征至關重要，已成為新穎的抗癌靶點。Syros制藥公司致力于癌癥和疾病的基因控制療法的開發，其候選產品包括SY-1425、SY-2101和SY-5609。本文分享了SY-5609的發現過程。從一系列強效氨基嘧啶CDK抑制劑開始，通過關鍵氨基酸殘基的取代、ADME研究、親和力分析，結合晶體結構以及計算模擬，獲得了可口服的CDK7抑制劑SY-5609。SY-5609可誘導G2/M細胞周期阻滯，并誘導癌細胞凋亡，在體內能夠抑制CDK7，使小鼠模型中的腫瘤消退。
實驗結果
初始SAR探索及ADME和PK SAR的優化
根據已知研究，研究者首先設計了先導化合物1，其對CDK7有很強的抑制作用，但對細胞周期及轉錄CDKs （CDK2、CDK9和CDK12）的選擇性差。使用公開的CDK7晶體結構，研究者首先通過Docking分析小分子的結合模式，再使用表面等離子共振（SPR）分析化合物的結合動力學表征分子的親和力，優化化合物骨架，獲得具有高度選擇性的可口服的CDK7抑制劑。通過逐步的官能團替代、結合親和力及活性檢測，進一步獲得效能和選擇性均增加的化合物4。通過解析化合物4與CDK2的晶體結構（1.7 ?的分辨率），研究者進一步分析化合物結合模式及SAR，以進行基于結構的化合物優化。最后，對該系列的候選化合物進行了ADME特性分析（表1）。
根據ADME分析，結合SAR，研究者設計了一組類似物（表1），試圖利用官能團取代，使其既提供所需的藥效和選擇性，又提供所需的代謝穩定性和口服生物利用度。綜合各項性質，研究者選擇了SY-5102作為進一步探索潛在選擇性口服CDK7抑制劑的化合物。
在HCC70細胞的異種移植小鼠模型中，當SY-5102日給藥達到兩次（BID）時，在4mg /kg劑量下顯示出劑量依賴性的腫瘤生長抑制（圖1）。該結果表明，口服非共價的選擇性CDK7抑制劑可以明顯抑制腫瘤生長。以SY-5102為基礎，研究者進行進一步優化，以期改進其PK，達到每日一次的劑量及更高的選擇性。
表1 先導化合物的特性。表格來源：JMC
圖1. ?SY-5102在HCC70腫瘤中的作用。?圖片來源：JMC
參考 SAR研究以及分子建模結果，研究者將偕二甲基移動到6位，得到SY-5609。經實驗驗證，SY-5609提高了對CDKs的選擇性，并表現出與CDK7/Cyclin H有效的（Kd?= 0.07 nM）和緩慢的（koff?= 0.0032 s-1）結合。這可能有助于增強HCC70抗增殖活性。SY-5609不僅能有效抑制HCC70細胞增殖（EC50值1 nM），且相對于化合物9和11表現出更高的親脂性和透膜性（LogD = 2，MDCK Papp?3.91 cm/s）。此外，它在小鼠肝微粒體中有較好的穩定性，表現出顯著的口服生物利用度（47%F）。
計算模擬
為進一步分析SY-5609與CDK7可能的結合模式，以解釋其高選擇性，研究者結合CAK復合物（CDK7/Cyclin H/MAT1）的冷凍電鏡結構進行進一步分析。研究過程使用了以ATP-γ-S為配體（PDB: 6XBZ），以共價抑制劑THZ120為配體（PDB: 6XD3），以ICE0942/ CT7001為配體（PDB: 7B5Q）的三種結構。
SY-5609上的二甲基氧化膦部分采用了與氧的剛性構象，從二甲基氧化膦共平面到吲哚NH，它以氫鍵形成假三環。在SY-5609的小分子X射線晶體結構中也觀察到這種低能構象，表明其可能也有助于提高SY-5609的滲透性。這個環狀系統靠近柔性的激酶P-loop環，特別是從Gly19到Ala 24的殘基。由于相似的鉸鏈結合相互作用，缺乏共價連接，且分辨率高，因此研究者選擇PDB結構7B5Q來建模SY-5609與CDK7的相互作用。
圖2. ?SY-5609與CDK7模擬結合模式的計算分析。?圖片來源：JMC
為保留內部氫鍵，研究者將小分子X射線晶體學觀察到的SY-5609構象剛性對接到CDK7激酶結構域中。在對接結構中，Met94和氨基嘧啶之間存在預期的氫鍵相互作用，6，6-二甲基哌啶氮與Asp97形成鹽橋，而嘧啶的5-三氟甲基與Phe91發生相互作用。
以SY-5609、CDK7、Cyclin H和MAT1的剛性對接復合物為起點，研究者進行了50 ns的分子動力學模擬，以研究水分子介導的相互作用的貢獻和蛋白柔性。如圖2，SY-5609的選擇性可能是由哌啶環上的二甲基取代引起的，其指向K -螺旋頭部的疏水Val100（這是CDK7特有的殘基）。這種取代可能與CDK2的極性Lys89發生沖突。在CDK9和CDK12中，對應的殘基是一個體積更小的、疏水性更小的甘氨酸。在CDK7中，偕二甲基可能與Val發生范德華相互作用。這種作用可能被鄰近的鹽橋鎖定，并在CDK9和12中丟失，對這些靶點的選擇性也隨即增加。然而SY- 5609的選擇性遠高于化合物6，因此不能完全通過這些相互作用進行解釋。剛性對接數據未能闡明任何額外的特異的相互作用。
研究者發現，6位腈基和7位二甲氧基膦可能通過利用P-loop環的構象偏好來驅動選擇性。有證據表明，C-6腈基和Glu20的主羰基之間存在瞬時的水分子介導的相互作用。圖2中的序列比對突出了殘基22和25之間的差異。特別是Ala24作為CDK7所特有的，它可能改變了loop環的靈活性，并在靠近氧化膦甲基的較低側提供了更疏水的接觸表面。SY-5609/CDK7的對接結構和其他CDKs激酶結構域的疊加中，也可明顯看到不同的P-loop構象。
CDK7 P-loop從Gly 19周圍的結合位點向外發散，Phe23周圍的loop環末端相對于其他CDKs向上傾斜，可能使CDK7比其他CDKs更好地適應SY-5609，同時保留了關鍵的極性相互作用。CDK7 P-loop的柔性曾被認為對配體的選擇性很重要。研究者對SY-5609與 CDK2/CyclinA、CDK9/CyclinT1和CDK12/Cyclin K對接的復合物以及所有4種CDKs 無SY-5609的復合物(apo復合物)進行了分子動力學模擬（50 ns）。同時，研究者通過測量Gly19和Ala24對應殘基的平均phi和psi二面角來監測loop環的構象。結果只有在CDK7中，apo復合物和SY-5609結合態之間的測量值具有可比性，這表明P-loop環基本不需要重排來適應配體，暗示著其在選擇性中的貢獻。
CDK家族和基因組的選擇性
為進一步分析SY-5609對CDK的選擇性，研究者對SY-5102和SY-5609進行了28個CDK家族的分析，并在485種激酶中測量了更廣泛的激酶組選擇性。結果表明SY-5609的選擇性比SY-5102更強，且只有10種激酶在1μM SY-5609時表現出大于70%的抑制作用（圖3）。這些數據表明，在治療相關濃度下，其他激酶不太可能發生顯著參與。
圖3 SY-5102和SY-5609的基因組選擇性。圖片來源：JMC
SY-5609的細胞活性
在細胞活性的研究中，SY-5609在TNBC、OVA腫瘤細胞系中表現出較強的抗增殖作用，而在兩種正常成纖維細胞系中僅在最高劑量下顯示出超過50%的抗增殖作用。HCC70細胞系中，SY-5609對CDK7的細胞周期和轉錄靶點均存在影響。用SY-5609處理24和48h后，可以通過丟失CAK功能來抑制CDK2在Thr160位點的磷酸化（圖4A）。
在TFIIH中抑制CDK7會導致RNA聚合酶IIc端結構域的七肽重復序列中Ser5的磷酸化水平降低，而c-Myc的水平降低（圖4A）。在多個癌細胞系中，SY-5609處理48和72h可誘導細胞凋亡，而原代成纖維細胞沒有被誘導凋亡（圖4B）。此外，SY-5609處理后G2/M細胞周期發生阻滯（圖4C），這是CAK功能喪失的結果，與SY-5609處理24和48 h時觀察到的Cyclin B1積累一致（圖4A）。
圖4. SY-5609的細胞活性。圖片來源：JMC
SY-5609的體內藥效
研究者在HCC70細胞的異種移植小鼠模型中測試了SY-5069的體內藥效。小鼠每日口服2mg/kg SY-5609，血漿暴露量為261.28 ng h/mL，Cmax為50.67 ng/mL（103nM），消除半衰期為3.33h。在給藥的21天內誘導了腫瘤消退，耐受性良好。直到第28天，仍未見腫瘤復發（圖5）。
此外，研究者監測了涉及細胞周期和對CDK7抑制的轉錄反應的標記物（圖5）。在單次2mg/kg劑量后的4小時內，RNA聚合酶II的Ser5磷酸化和CDK2的Thr160磷酸化均降低，而c-Myc和MCL1蛋白水平基本保持不變。c-Mycm RNA的表達也降低了，這為CDK7轉錄功能的快速抑制提供了證據。7日給藥后，CDK2 p-T160和p-Ser5的減少保持不變，c-Myc和MCL1蛋白水平也降低。這些結果與其細胞活性和體內藥效相一致（圖4），說明了其對細胞周期（pCDK2）、轉錄（pSer5和c-Myc）和細胞凋亡（MCL1）的影響。
圖5. SY-5609的體內藥效。圖片來源：JMC
結論
研究者通過計算模擬結合實驗，篩選到有效且高度選擇性的CDK7抑制SY-5609，支持每日口服給藥。用SY-5609處理HCC70細胞會導致細胞周期CAK靶點和TFIIH靶點的減少，且呈劑量依賴性；可導致G2/M細胞周期阻滯和c-Myc等重要致癌基因的下調，最終導致癌細胞凋亡。SY-5609在體內外實驗中都表現出了顯著的藥效和選擇性。該實驗結合計算的研發過程對抗癌小分子的開發具有指導意義。
參考文獻
Marineau JJ, Hamman KB, Hu S, Alnemy S, Mihalich J, Kabro A, Whitmore KM, Winter DK, Roy S, Ciblat S, Ke N, Savinainen A, Wilsily A, Malojcic G, Zahler R, Schmidt D, Bradley MJ, Waters NJ, Chuaqui C. Discovery of SY-5609: A Selective, Noncovalent Inhibitor of CDK7. J Med Chem. 2021 Nov 2. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c01171. Epub ahead of print. PMID: 34726887.