JMC | 如何發現難以藥物靶向的靶標的先導化合物大環類天然產物的發現

背景介紹

在所有已被發現的與人類疾病有關的靶標中，有超過一半的靶標被認為很難依靠符合Lipinski的“類藥五規則”（Ro5）的傳統小分子藥物來調節，蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）、蛋白酶、某些激酶以及轉移酶和異構酶就是其中重要的例子。這些難以藥物靶向的靶標通常具有大的、無特征的、高度親脂性或高度極性和高柔性的結合位點。尋找細胞內難以藥物靶向的具有口服生物利用度的藥物是一項艱巨的任務，通常需要在Ro5以外（bRo5）的未知化學空間中發現相應配體。大環化合物能夠在bRo5空間中的口服藥物中富集，因為與傳統的小分子相比，它們可以與具有大而無特征的結合位點的靶標更好的結合。此外，大環化可以改善血漿穩定性、細胞通透性和口服吸收。但是，大環化合物在篩選分子收集庫中的代表性通常不足，限制了其在先導化合物生成中的使用。例如，阿斯利康（AstraZeneca）分子收集庫中總共有380萬種化合物，但包含不到17000個大環化合物。

盡管有越來越多的bRo5化合物進入了臨床試驗，但難以系統地研究難以藥物靶向靶標的先導化合物的生成，并且隨著化學空間隨著分子體積大小的增加而急劇擴大，這是一個很大的挑戰。天然產物是重要的藥物來源，我們假設大環的核心可能是自然界的優勢子結構，并且在難以藥物靶向靶標的先導化合物的生成中可以發揮作用，就像傳統藥物的分子片段一樣。類先導化合物的大環核的集合隨后將可用于對靶標（例如PPI）進行計算機篩選，隨后的優化可以提供新穎的先導化合物。在這里，我們報告了通過對大環天然產物化學空間的全面研究，如何生成兩組可用于發現難以藥物靶向靶標的先導化合物的大環核心。通過將更小和更像先導化合物的化合物對接到Keap1上Nrf2的高電荷結合位點中，確定了環噻啶的核心是Keap1的潛在抑制劑；使用核的結構簡化類似物進行第二輪對接研究，然后進行合成，確定了Keap1-Nrf2 PPI的弱抑制劑?；谠揾it抑制劑合成了另外九種優化的化合物進而得到了活性在低μM范圍內并顯示出細胞活性的抑制劑14。Keap1和14的復合物的晶體結構揭示了不帶電的大環分子14如何與Keap1的帶電結合位點結合，并為其進一步優化提供了基礎。

結果1: Dictionary of Natural Products的挖掘

Dictionary of Natural Products (DNP) 包含超過15萬種化合物，涵蓋了廣闊的化學空間，其中包括已經批準上市的口服和非腸道藥物（圖1a）。因此，我們認為DNP是用于鑒定大環核心的有吸引力的來源。首先，使用在Pipeline Pilot中實施的HTS過濾器從DNP中除去含有已知毒理基團和非?；顫姷幕鶊F的天然產物，該過濾器除去了包括?；u、酸酐、重氮基團和酰肼在內的幾種官能團。然后，將剩余的化合物進一步過濾，以包含至少一個大環，不超過十個較小的環，并且分子量（MW）小于2500 Da（圖1b），這一步刪除了所有非大環和大型大環，例如多糖或多肽性質的大環，最終獲得了3657個大環的數據集。使用先前報道的片段生成算法的前兩個步驟，將該數據集側鏈修剪到由至少兩個與大環連接的重原子或官能團組成的連接點。過濾得到的擴展的Murcko骨架（本文中稱為大環核），使其至少包含總共三個氧和氮原子并且小于15個可旋轉鍵，從而去除不太可能發展為藥物的高親脂性和柔性核。整個大環收集流程下來，得到了將近2200個結構不同的核心，這些核心被聚集成217個代表性核心的集合。通過視覺檢查去除了含有少量剩余反應性基團（如二硫化物、過氧化物和烷基鹵化物）和具有高度合成復雜性的核以及寡聚體（寡肽和寡糖）。這提供了較小的41個更加類似先導化合物的核心的數據集，這些核心在很大程度上遵守了Lipinski的5規則。這組核心來自已經報道其絕對立體化學的35種天然產物以及僅了解相對立體化學的三種天然產物。這兩組核心構成了獨特的計算機篩選分子庫，且兩組核心之間的結構復雜性各不相同，其中一些很容易合成，而簡化的類似物可能是其他大環化合物更有吸引力的起點。

圖1.?從DNP中挖掘的大環核心

圖片源自JMC

結果2：Keap1-Nrf2 PPI的新型抑制劑

我們選擇了Kelch樣ECH相關蛋白1（Keap1）和核轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）之間的PPI來評估我們的大環核心數據集。Keap1-Nrf2系統是氧化應激的重要細胞應答機制，氧化應激涉及許多慢性、年齡相關或炎癥性疾病。該PPI的抑制劑是藥物開發的主要興趣，因為Nrf2控制著幾種細胞保護性基因的表達，但通過與Keap1的復合作用而受到負調控，從而導致其泛素化和降解。Keap1-Nrf2 PPI由Keap1上的一個高度極性口袋組成，該口袋以高親和力結合Nrf2上的肽段序列DEETGE和其他帶負電荷的配體。我們假設大環由于其構象限制，可能在Keap1的極性結合位點提供最佳結合。與目前大多數為酸性的Keap1抑制劑相比，大環對于發現新型不帶電抑制劑十分理想，并且大環具有改善的細胞通透性和口服吸收性等性質。為了避免在對接大環核時偏向特定的結合位點構象，我們選擇了Keap1的四個高分辨率晶體結構，這些結構在結合位點上表現出差異：兩個結合小分子配體（PDB ID：4IQK和3VNG）和兩個空蛋白結構（PDB ID：4IFJ和1ZGK）。通過GlideScores確定對接Keap1結構最好的十個核心。然后，從合并的前十列表中找出已經對接到Keap1結構中的三個或四個的核心，并選擇它們作為潛在hit。有趣的是，由此產生的前五個大環表現出很大的結構多樣性（圖1c）。分析對接pose表明，環噻啶的核心很好地對接在所有四個Keap1結構中，能夠在結合位點深處結合并到達Kelch通道（圖1d）。誘導契合對接表明，環噻啶核的簡化類似物，如立體異構體6-9，其中亞苯基的羥基和甲基以及脯氨酸的羥基已被去除（圖2a），也能夠與Keap1結合。特別地，在溶液分析（ISA）中基于表面等離子共振（SPR）的抑制實驗中，有9種能夠抑制Keap1與Nrf2衍生肽的結合（KD = 237μM）（圖2a）。將I-脯氨酸部分的立體化學轉化為10導致結合親和力降低，這表明其對抑制Keap1的重要性，而I-脯氨酸的羥基化（11）則保持KD（圖2a）。重要的是，用不同的酰胺（12–15）取代甲酯可提供二甲酰胺14，其活性比9強2個數量級。開環16的活性大大低于14；同樣，大環分別擴展一個和三個原子（17和18），也失去了結合親和力，證實了大環對于抑制Keap1的關鍵作用。ISA中14的活性通過直接SPR結合測定法和等溫滴定熱法（ITC）證實，這為Keap1提供了幾乎相同的親和力（圖2b，c）。大環14通過抑制與Keap1的結合而誘導Nrf2易位進入細胞核，顯示出細胞活性（圖2d）。此外，14具有較高的水溶性、跨Caco-2細胞單層的中低滲透性以及中等的體外微粒體清除率。因此，14是一種有前途的先導化合物，可以進一步優化為不帶電的非酸性的靶向Keap1的高級先導化合物。

圖2.?環噻啶類似物的表征

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結果3: 抑制劑14與Keap1的復合物結構

我們確定了大環分子14和Keap1在2.4 ?分辨率下的復合物結構，以了解不帶電荷的14如何與Keap1的帶電和極性結合位點結合。晶體結構證實14與Nrf2一樣結合在Keap1的同一個極性結合位點（圖3a）。對結構的分析表明，亞苯基和大環的一部分被楔入R415和A556之間的相當疏水的口袋中，除了R415和14之間的陽離子-π相互作用外，復合物僅通過少數極性相互作用得以穩定。此外，有個氯離子橋接了14中的Ser的NH和Keap1中的三個殘基，與通過基于片段的藥物發現鑒定的具有高效抑制劑的復合物相似。由于在SPR和ITC分析以及細胞Nrf2易位分析中使用了生理鹽條件，因此我們認為這種復合物的形成也發生在生物學相關的環境中。大環化合物14在結合位點采用緊湊且穩定的結合構象的能力解釋了為什么開環和擴環類似物16-18對Keap1具有顯著較低的親和力。Pro的一部分及其N-乙?；谌軇┲械谋┞斗弦韵率聦崳河昧u脯氨酸（化合物11）替代不會影響抑制活性。使用Prime MM-GBSA進行配體結合親和力計算，從而提供了對活性差異的潛在原因以及14和Keap1之間復合物穩定作用力的解釋（圖3b）。與實驗解離常數相符，大環14被預測對Keap1具有最高親和力，其中9和13被預測為中等，而12和15被預測為相對較弱。我們發現非極性范德華和親脂性相互作用是14的結合親和力的主要貢獻者，并且它比抑制劑9和13具有更高的親和力。根據計算，非活性化合物12通過更強的極性（庫侖）相互作用而得以穩定，但同時被較大的去溶劑化作用抵消；而非活性化合物15形成了所研究的五個化合物之中最弱的極性（庫侖）和范德華相互作用。有趣的是，兩個14的N-甲基與Pro和N-乙?；聂驶g的距離表明在這些殘基之間形成了兩個分子內非經典氫鍵（圖3a），這一發現得到了量子力學計算的支持。非經典氫鍵比氫鍵弱，但是兩個分子內非經典氫鍵可能會提供額外的構象限制來穩定14與Keap1的結合。?

圖3.?Keap1-14復合物的表征

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結果4: 抑制劑14與其他Keap1抑制劑的比較

從七個指紋中計算出用來描述結構多樣性的Tanimoto系數，結果顯示抑制劑14與PubChem和驗證數據集中的化合物相似性較低（圖4a）。Keap1抑制劑空間的多樣性是通過類似網絡的相似性圖進行研究的，該相似性圖來自抑制劑14、組合的驗證組和PubChem組以及單獨的驗證組計算得出的子結構片段指紋。組合數據集的相似性圖與驗證組的一樣，均證實了大環化合物14在化學空間中占據了唯一的沒有相似結構的位置（圖4b，c）。組合數據集還顯示，Keap1抑制劑的空間相當多樣，大多數抑制劑幾乎沒有結構上的相似化合物，只有大簇位于圖的左中心。該簇包含一系列已驗證的抑制劑V1代表的鄰苯二甲酰亞胺（圖4c）。1,4-二氨基萘V3、環磺酰胺V7和二唑V8（圖4c）是經過藥物化學優化后獲得的最有效的Keap1抑制劑。但與14相反，它們都含有羧酸?？偠灾?，Tanimoto系數和類似網絡的相似圖都凸顯了使用天然產物核心作為結構獨特的Keap1抑制劑來源的潛力，該Keap1抑制劑屬于與先前報道的抑制劑完全不同的另類化合物。

圖4.?抑制劑14與已經報道的Keap1-Nrf2 PPI抑制劑的結構相似性

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總結

近來，天然產物也已被用作三維（3D）片段的來源，并啟發了通過面向多樣性的合成（DOS）制備化合物集合的設計靈感。此外，還有通過將天然產物衍生的片段組合和融合來設計假天然產物。但是，天然產物及其衍生物通常具有復雜的結構。我們展示了如何通過兩輪對接較小的一組類先導化合物的大環核心來識別出環噻啶核，然后通過化合物6–9的對接使其針對靶標Keap1量身定制，同時降低結構復雜性。通過這種方式，減輕了天然產物的主要缺點之一，即它們通常需要通過較長的合成路線來制備?？傊?，本文報道的大環核心說明了如何利用自然界的優勢子結構及其多樣性作為藥物發現的高質量起點的豐富來源。

參考文獻

F. Begnini, V. Poongavanam, B. Over, M. Castaldo, S. Geschwindner, P. Johansson, M. Tyagi, C. Tyrchan, L. Wissler, P. Sj?, S. Schiesser, and J. Kihlberg, Mining Natural Products for Macrocycles to Drug Difficult Targets, J. Med. Chem., 2021, 64, 2, 1054-1072. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.0c01569.