一種基于幾何結構軟件和深度學習的新框架DeepPoc一套挖掘苗頭片段周圍的化學空間的流程，它可以找到結合模式相似且新穎的類似物。在對BRD4案例的測試中，該流程發現了新穎的活性分子，IC50 為 26 μM。ket，用3D卷積神經網絡對Fpocket識別的口袋重新評分后能發現蛋白表面的空腔。
背景介紹
基于片段的藥物設計已成為發現新候選藥物的常用手段。優化片段的方法通?；诿珙^分子，對初始片段的骨架小做修改。實際上，苗頭片段周圍的化學空間可以提供新的類似分子并具有更高的活性概率。這種探索片段空間的方式可以發現次優的苗頭片段，揭示更傳統的片段優化過程中被忽視的未探索途徑。
巴塞羅那大學的Xavier Barril團隊設計了如下片段挖掘流程：(1) 對化學庫可擴展空間的探索；(2) 骨架躍遷探索苗頭片段周圍的多樣性；(3) 利用結構信息增加活性分子概率；(4) 迭代逐步生長片段，提高配體效率增加效力；(5) 自動化減少人工干預。作者將該流程用在了含溴結構域的蛋白質 4（BRD4）并找到了具有新穎性的骨架。
主要內容
片段挖掘流程
如圖 1 所示。該流程從已知結合模式的初始片段開始，保留基本相互作用以增加選擇活性化合物的機會；接著對ZINC15子集做相似性搜索。搜索僅限于與參考配體大小相似的分子，每次迭代最多添加兩個重原子。該約束保證了配體效率，并避免偏向于搜索更大分子，這種搜索方式可以使分子結構更豐富并獲得更好的絕對分數。
作者將檢索到的分子按以下兩步過程疊加到查詢分子上，確保關鍵的相互作用和結合模式：(i) 用原始片段識別最大公共子結構 (MCS)，其中必須包括關鍵相互作用點；(ii) MCS 上做原子的疊加，然后進行對接，其中 MCS 受到限制，只有 MCS 外的可旋轉鍵被對接算法采樣，這樣做是為了優化分子間相互作用的同時仍保留參考配體的結合模式，最終從中選擇得分最高且相似度超過90%的 500 個分子。接下來再用dynamic undocking (DUck) 過濾掉對接不穩定的分子，最后選擇得分最高的 50 個分子。
初始苗頭片段周圍的化學空間的代表性樣本數量跟數據庫的分子相比不值一提，在一輪迭代篩選過程后，使用篩選出的50個分子重新作為迭代起點。如果對這些分子中的每一個都進行相似性搜索，篩選出的分子數將會呈現指數性增長。為保持計算效率，所有相似苗頭片段均按共同親本的數量排序，并且僅考慮排名靠前的10萬個分子，防止搜索范圍過度分散。
圖1. 片段挖掘平臺流程圖。圖片來源：JMC
以BRD4為例展示如何使用流程找到新穎骨架
最初選取測試片段1XA（PDB:4LR6）來研究流程是否可以從已知類型中識別出新物質。異惡唑環在BRD4抑制劑中很常見，其雜原子與 Asn140 的側鏈氮原子形成氫鍵，剩余的環可以進入空腔底部、空腔遠端和溶劑。
1XA 與抑制劑 (+)-JQ1 合并共同用于測試并迭代了4 次流程。在每次迭代結束時選擇50 個分子。每次迭代時參數如表1所示。為了驗證計算預測，測試分子樣本結果如表 2所示。作者應用了單一濃度的差示掃描熒光法 (DSF) 和通過 TR-FRET 的底物置換試驗測得 IC50 值。52% 的測試分子在 DSF 中給出陽性信號，35% 在 TR-FRET 測定中呈陽性。22% 在兩種測定中都是陽性的分子被認為是有效的苗頭片段。其中有三個片段通過 X 射線晶體學確定了它們的結合模式。
表1. 每輪迭代得到的分子信息統計;表2. 生物測試的結果。表格來源：JMC
首輪迭代
由于 1XA 有 13 個重原子 (HA)，該平臺篩選了重原子數在11-15的近 100 萬個分子，其中只有 4%?進入下一步。疊加 MCS 和對接后，9622 個分子 (24%) 的對接相互作用評分不差于1XA (-16.2kJ/mol)。作者以 4 kcal/mol作為閾值，從55500 個分子中找出了58個分子，從供應商購買了骨架不同的5個分子。值得注意的是，3 作為母體片段 1XA (IC50 = 91μM) 是無活性的 (IC50 = 72 μM)，在LE方面略好（0.47 vs0.42 kcal/mol/HA）。結合模式如圖 2所示?；衔?3 保留了兩個與 Asn140 相互作用的氫鍵受體，異惡唑被換成噠嗪；1XA 的伯胺變成吡唑環。較寬的相似性搜索要求下可能出現這種激進的骨架變化，嚴格的對接和 DUckfilters 可確?；镜牡鞍灼蜗嗷プ饔?。?
圖2. BRD4與化合物3復合物的X射線結構
后續迭代
作者還前瞻性地評估了流程逐步增加虛擬苗頭片段的功能。一般情況下，研究人員希望在每個周期后安排實驗測試，識別活性分子并剔除非活性分子，這么做不切實際。但是多次迭代而不篩選可能產生假陽性分子，存在錯誤的分子迭代和效果下降的風險。迭代的分子也存在不可購買的難題（表 2 和圖 3），最后一次迭代收斂到具有常見 5-苯基噻唑并[2,3-c][1,2,4]-三唑骨架的分子，但是這些分子都無法購買。因此，作者合成了代表性分子23，總共測試了 18 個分子。其中，8 個 (44%) 被 DSF 檢測為有活性，7 個 (39%) 被 TR-FRET 檢測到。命中率與第一次迭代獲得的結果一致，證實進化過程沒有偏離到假陽性。兩種最有效的分子9(IC50 = 30 μM)和23 (IC50 = 26 μM)，通過 X 射線晶體學確定了結構（圖 4；PDB：6ZEL 和 6ZF9），與預測的結合模式一致。23與 3 一樣，它代表了不劇烈的骨架躍遷，LE = 0.39，是全新的BRD4 配體。?
圖3. 流程發現并測試活性的分子。圖片來源：JMC
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圖4. BRD4與化合物9復合物,23復合物的X射線結構
骨架分析
流程的特征之一是專注于苗頭片段所在空間，識別出非明顯的類似物。由于描述骨架的方式不同，作者嘗試了化學骨架和拓撲骨架兩個角度。對于第一類，作者使用 Bemis 和 Murcko 的化學骨架算法。對于第二類，作者使用鍵通用支架，其中僅保留環原子并刪除元素和雜交信息。
在第一次迭代中，1XA的原始骨架代表了 50 個選定分子中的 7 個分子。當作者考慮拓撲骨架時則代表了23個分子（圖 5）。在這個階段，50 個分子代表了 33 種不同的化學支架和 13 種拓撲支架（圖 6；表 3）。14 個分子（28%）呈現出適度的拓撲骨架轉換，剩余的 13 個分子呈現出與原始分子差異更大的拓撲支架。該分析證實，大部分所選分子在原始片段的傳統搜索中無法檢索到，連續的迭代能使搜索遠離化學空間。第一次迭代中兩個更頻繁的拓撲支架（表 3 中的數字 1 和 4）保留在第二次迭代中，但頻率降低（從 60% 到 24%）。在本次迭代中，中等支架變化的分子數從 13 個增加到 15 個，算法開始實質性的拓撲修改。在第三次迭代中，趨勢加速，這是探索性的步驟，有 24 個拓撲支架和 39 個化學支架，骨架分散到了無關的分子中。流程只考慮那些具有大量共同親本的分子，遏制分散的趨勢以降低獨特骨架的數量。但是此時流程已經找出了一個優勢骨架。23 和3具有完全新穎的化學和拓撲支架。因此，盡管已經知道大量 BRD4 抑制劑，但流程能基于苗頭片段的周圍化學空間中發現全新的 BRD4 支架。?
圖5. 第一輪迭代的苗頭化合物的骨架多樣性。圖片來源：JMC
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圖6. 主流的拓撲骨架。圖片來源：JMC
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表3. 四輪迭代后，在200個苗頭分子中，出現頻數大于4次的骨架統計信息。表格來源：JMC
總結
本文介紹了一種計算平臺，可以從特定苗頭片段周圍的化學空間中，尋找出結構多樣的可能遺漏的片段類似物。它還可以迭代使用，逐漸偏向于具有更高分數分子的化學空間區域。此過程可產生高命中率，并且收斂于優勢骨架。但應該注意的是，該平臺不能用于片段生長。為了進行深入搜索更有效的類似物，需要限制化學空間探索的廣度。
參考文獻
Serena G. Piticchio, Míriam Martínez-Cartró, Salvatore Scaffidi, Moira Rachman,?Sergio Rodriguez-Arevalo, Ainoa Sanchez-Arfelis, Carmen Escolano, Sarah Picaud, Tobias Krojer,?Panagis Filippakopoulos, Frank von Delft, Carles Galdeano, and Xavier Barril. Discovery of Novel BRD4 Ligand Scaffolds by Automated Navigation?of the Fragment Chemical Space, Journal of Medicinal Chemistry, 2021, 64(24), 17887-17900.