先睹為快
作者
日本武田制藥Michiko Tawada
研究對象?
O-連接的N-乙酰葡糖胺水解酶：O?GlcNAcase （OGA）
計算方法
同源模建（Homology Modeling）
分子對接（Docking Calculations）
基于形狀的相似性搜索（Shape-based similarity search）
虛擬篩選（Virtual Screening）
WaterMap分析（WaterMap Analysis）
分子動力學模擬（Molecular Dynamics (MD) Simulation）
計算軟件
ROCS version 3.2; Maestro version 10.4
計算流程
首先基于已知OGA抑制劑的結合構象，應用ROCS篩選了包含2000000分子數量的化合物庫，初步選出約100000個化合物；然后，將化合物與人類OGA蛋白對接，選出與蛋白有相互作用的7萬個化合物；接著，根據設置的理化參數過濾化合物，保留了55000個化合物；隨后剔除假陽性化合物（PAINS），篩選出53000個化合物；最后，將化合物分為2681個簇，并對每個簇中排名靠前的2681個化合物進行生物活性分析。
引言
眾多周知，Tau蛋白的過度磷酸化是神經退化性疾病的主要特征。然而，Tau蛋白在體內除了被磷酸化修飾還可被O-GlcNAc 糖基化修飾。研究發現，如果提高Tau蛋白的O-GlcNAc水平，可有效降低Tau 蛋白的磷酸化程度。O-GlcNAcase（OGA）是生物體內唯一水解蛋白質O-GlcNAc 糖基化修飾的酶，因此，靶向OGA的抑制劑研究逐漸成為開發神經退化性疾病藥物的熱點話題。
目前報道的OGA抑制劑（圖1）多是糖衍生化的底物類似物，由于結構中多羥基取代特征，小分子不易透過血腦屏障。在2019年，經過結構修飾獲得的MK8719抑制劑能突破血腦屏障并具備了較好的藥代動力學特征，將進行下一階段的臨床試驗。然而，具有高效價和更好的藥代動力學特征的非糖類化合物亟需開發以幫助表征OGA。
近十年來，目前已經報道了幾種OGA-抑制劑復合物晶體結構，由于人類OGA的晶體結構在之前尚未報道，作者以細菌OGA為模板蛋白同源模建了人類OGA的蛋白結構?；诘鞍捉Y構，可以通過對接小分子庫篩選化合物；基于配體結構方法，通過晶體結構配體的結合構象，可以確定配體的空間和靜電特性，應用藥效團或形狀相似性篩選類似物。為了提高虛篩的命中率，作者結合了多種方法的虛擬篩選手段；并通過藥物性質和中樞神經系統（CNS）滲透的物理化學參數對化合物進行過濾，獲得了苗頭化合物；對已鑒定的苗頭化合物進行優化，以改善其藥代動力學和親脂性；最終獲得了具有較高的親和力和中等的親脂性的新型OGA抑制劑化合物5i，有望成為tau蛋白介導的神經退行性疾病的治療藥物。接下來，我們將詳細講述作者的研究過程和結果。
圖1.?已報道的OGA抑制劑的化學結構
圖片來源于JMC
研究內容
苗頭化合物的獲得
虛擬篩選的工作流程如圖2所示。虛篩的第一階段，作者基于化合物1a?1f（圖1中）的結合構象，應用ROCS（形狀相似性搜索的標準方法之一）篩選了包含2000000分子數量的化合物庫，初步選出約100000個化合物；第二階段，將化合物與人OGA蛋白對接，優先選擇出與蛋白有相互作用的7萬個化合物；第三階段，設置理化參數（分子量≤350，AlogP≤5，氫供體數≤4，拓撲極性表面積≤125，氫受體數≤8，可旋轉鍵數≤6）過濾化合物，保留了55000個化合物；第三階段，隨后剔除假陽性化合物（PAINS）篩選出53000個化合物；第四階段，根據分子相似性將化合物分為2681個簇，并對每個簇中排名靠前的2681個化合物進行生物分析。
圖2.?虛擬篩選的工作流程
圖片來源于JMC
在10μM濃度下測定了虛篩所得2681個化合物的OGA抑制活性，鑒定出13個抑制率超過50%的化合物。隨后的劑量-反應分析使作者最終鑒定出化合物2（IC50 = 41 nM）,并證實其可以選擇性抑制OGA。作者構建了化合物2與OGA的對接模型（圖3），比較不同立體異構體、R-型和S-型以及可能pH范圍內存在的質子化狀態下的結合模式，其中N-1和N-4質子化的S-異構體表現出最合理的結合模式。在這種對接模式下，嘧啶的N-1和鄰近的-NH與Asp285的羧基形成雙齒氫鍵；甲基哌啶基團與Tyr219和Trp278形成類似三明治的π-π堆積；哌嗪基團插入到活性口袋的入口處。為了進一步闡述配體結合位點和蛋白質的性質，作者應用Schr?dinger中的WaterMap工具對化合物2-OGA的對接模型進行結合熱力學計算。在這種方法中，水分子置換到活性位點并分析自由能變化，可提供蛋白口袋相關性質的豐富物理見解。根據WaterMap計算結果（圖3c），三個最不穩定的水分子1、2和3，聚集在由Tyr219和Trp278組成位置。根據Tyr219和Trp278周圍的疏水側鏈推測及SiteMap表明該位點是疏水的。在SiteMap繪制的表面圖中，該位點主要被疏水表面覆蓋；盡管這個疏水口袋顯示出傾向于選擇配體的疏水取代基，但是由WaterMap計算的水分子的性質表明雜原子也是可以被接受。在Asp285附近觀察到ΔG值低于?1 kcal/mol的四個最穩定水分子，該位置的水分子顯示出較大的焓增益，水分子1′和4′與Asp285形成氫鍵，并且與化合物2中的氨基嘧啶基團的氮原子有很好的重疊；在口袋入口處的殘基Val255和Tyr286周圍觀察到具有中等自由能值的水分子，這表明口袋入口允許各種取代基；附著在手性碳上的甲基對結合親和力沒有顯著貢獻。
圖3.?化合物2與OGA的對接模型
圖片來源于JMC
先導化合物的發現和優化
基于WaterMap計算結果，作者將化合物2中哌嗪環替換成了苯乙基，并且去掉了手性碳原子的甲基得到了化合物5a，其仍保持對OGA的抑制作用。作者基于5a的化學結構進行了后續理化性質的優化，重點考慮了配體親脂性效率（LLE）。為了降低配體的親脂性，引入了六元環胺，如嗎啉和甲基哌嗪；引入極性取代基對哌啶進行了進一步的修飾，羥基或甲氧基的引入沒有產生有益的效果；另一方面，根據WaterMap計算數據展示苯乙基可以進行不同的修飾，用含氮雜環化合物修飾得到化合物5i（IC50=46nm；LLE=5.2），其具有理想LLE值的強效OGA抑制劑的特征。通過對化合物5i在細胞中的藥效、選擇性和藥代動力學進行了詳細的表征，結果表明5i是有效性的OGA抑制劑，并具有良好的血腦屏滲透性。
化合物5a/i的結合模式分析
作者解析了化合物5與細菌OGA的X射線晶體（圖5a）。與人類OGA同源模型相比，化合物5a在晶體結構中表現出類似的蛋白質-配體相互作用模式；氨基嘧啶與Asp344（對應人類OGA中的Asp285）形成雙齒氫鍵；甲基哌啶基與Tyr282和Trp337形成π-π堆積，與蛋白形成緊密的疏水作用；兩種結構之間的差異在于位于門控區的Asp242（對應于人類OGA中的Asp174）的構象；值得注意的是，在上述晶體結構中還觀察到小分子自身嘧啶核和末端苯環之間形成分子內π-π堆積，這種堆積作用有助于保持5a的剛性構象。將苯環替換為吡啶環（見5f和5g），其特點是π-電子密度較低，降低了π-π堆積效應。
作者基于5a-OGA的晶體結構構建了5i與人類OGA的對接模型（圖5b）。除了5a中觀察到的與Asp285、Tyr219和Trp278（分別對應于細菌OGA中的Asp344、Tyr282和Trp337）的常見相互作用外；還發現末端甲基咪唑與蛋白口袋入口處的Val254和Tyr286形成了CH-π作用；與化合物5a相比，由于烷基連接長度減少，未形成分子內π-π堆積作用；但與Val254和Tyr286的CH-π作用彌補了親和力，仍保留對OGA的抑制效力。作者進一步采用分子動力學方法（MD）擬了5i與人OGA同源模型的復合物，證實所預測的結合模式和關鍵相互作用的穩定性。?
圖4.?化合物5a?i的OGA抑制活性和配體親脂性效率
圖片來源于JMC?
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圖5. (a) 化合物5a-OGA的晶體結構；
（b）化合物5i-OGA的對接模型
圖片來源于JMC
結果與討論
作者結合了多種方法的虛擬篩選手段，并通過藥物性質和中樞神經系統（CNS）滲透的物理化學參數對化合物進行過濾，獲得了苗頭化合物；對已鑒定的苗頭化合物進行優化，以改善其藥代動力學和親脂性；最終獲得了具有較高的親和力和中等的親脂性的新型OGA抑制劑化合物5i。其可作為闡明OGA在神經退行性疾病中作用的體內化學工具，有望成為tau蛋白介導的神經退行性疾病的治療藥物。
參考文獻
Michiko Tawada, et?al. Discovery of a Novel and Brain-Penetrant O?GlcNAcase Inhibitor via Virtual Screening, Structure-Based Analysis, and Rational Lead Optimization.?J. Med. Chem. 2021, 64, 1103?1115.