先睹為快
靶點
胰高血糖素樣肽1-受體（GLP-1R）
計算方法
分子對接，分子建模
計算軟件
Schr?dinger，MOE，Cubist
單位與作者信息
賽諾菲-安萬特María Me?ndez，Hans Matter
發表雜志
Journal?of?Medicinal?Chemistry
計算流程
將胰高血糖素樣肽1-受體-肽激動劑復合物晶體結構（PDB code: 5NX2）導入Schr?dinger的蛋白質準備模塊進行準備，用LigPrep制備配體結構，并使用Glide XP將配體對接至GLP-1R模型中，Induced fit docking用于限制參考配體9的對接姿勢，其對內核的弱約束力使吲哚部分趨于合理排列，給其余配體對接提供指導。ADME模型則由Corina生成規范3D幾何坐標，基于MOE產生2D-QSAR。Cubist構建一個基于規則的決策樹并用C5.0開發定量分類模型，對259種化合物進行性質預測。
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背景
胰高血糖素樣肽1-受體屬于B類G蛋白偶聯受體（GPCR），是治療2型糖尿?。═2DM）的有效靶點。目前市面上被批準用于治療T2DM的藥物多是可注射的幾種GLP-1R肽激動劑，在使用過程中普遍存在惡心和嘔吐的現象，這激發了研究人員尋找肽變體或充當GLP-1R激動劑或正變構調節劑（PAMs）的小分子的熱情。尤其是PAM，做成口服液可大大提高患者的便利性以及對最大治療功效的依從性且PAM不會干擾內源肽水平，這是對抗完全激動劑的一大優勢。目前采用兩種方法來用小分子激活GLP-1R，尋找能夠增強內源性配體GLP-1(7-36)NH2或活性低得多的降解產物GLP1(9-36)NH2的活性的直接激動劑或PAM。較早的GLP-1R小分子激動劑有非藥性質，如具有高親脂性和分子量，口服后血漿暴露量會降低。vTv Therapeutics，輝瑞及禮來針對GLP-1R的直接激動劑的研發中開發了共價和非共價的PAMs，但均對化合物如何與T2DM疾病模型進行關聯及其體內藥學信息知之甚少?；贕LP1(9-36)NH2的體內活性高于GLP-1(7-36)NH2的事實，作者提出了增強GLP1(9-36)NH2的活性會產生有價值的治療方法的假設且用高通量篩選的方法對這一假設做出論證。
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HTS發現GLP-1R的正向變構調節劑
作者對賽諾菲的化合物進行了HTS鑒定，以確定內源性配體GLP1(9-36)NH2與GLP-1R相互作用的正向變構調節劑。該實驗在過度表達的人GLP-1R的HEK293細胞系中使用HTRF cAMP分析完成的。GLP-1(7-36)NH2的EC50值大約是GLP1(9-36)NH2的10000倍。進行篩選分析時，所有化合物均在正構配體GLP1（9–36）NH2的EC20濃度下進行測試，以更好地評估推定的HTS命中強度。隨后，測試了化合物在固定濃度為10和3μM的條件下改變內源性GLP1(9-36)NH2的EC 50值的能力，從而證明活性較低的內源性肽具有改善的生物學作用。一個基于3,4,5,6-tetrahydro-1H-1,5-epiminoazocino[4,5-b]吲哚骨架的化學系列在HTS分析中顯示特別高的活性（化合物8，PAM EC50 600nM/100%有效），在同源小鼠受體測定中，生物學活性相似或略有改善（PAM EC50 300nM/100%）。這一化合物系列來源于使用Pictet-Spengler分子內環化技術，基于類天然產物的骨架合成的化學文庫。該來源使研究人員能快速進行結構活性關系（SAR）評估?；衔?的高生物活性促使作者明白橋頭碳原子的立體化學式高GLP-1R活性所必需的的結構，由此，對8的結構進行進一步優化。
圖1.?化合物8和9的結構及化合物8-19的體外數據匯總
圖片來源JMC
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正向變構調節劑的合成及其分子藥理學研究
化合物19的合成采用略微修飾的合成方法。從Fmoc保護的色氨酸9a和胺結構單元15開始，通過HATU偶聯獲得中間體16。用Dess-Martin高碘烷氧化乙醇等一列系操作的得到了作為單一對映異構體的化合物19。14和19都是HTS命中的化合物8經進一步優化得到的類似物，二者在酰胺氮上均帶有極性取代基。在體外測定中，兩種化合物均顯示出相似的效力（化合物14和化合物19的 EC50/Emax 分別為1.5 nM/100%，5 nM/100%），但是，19在移動GLP1(9-36)NH2的EC50值的主要實驗中比化合物14表現優異（化合物19和14在10和3μM對EC50的改變分別為8188/2215和3143/526）。這是迄今為止報道的針對GLP-1R非共價PAM的最佳強化能力?；衔?4和19均被證明是GLP1(9-36)NH2的選擇性激動劑，在葡萄糖刺激的胰島素（GSIS）分析中，化合物14顯著改善了GLP1(9-36)NH2介導的葡萄糖刺激的胰島素在大鼠胰島中的分泌。在更高濃度的肽配體中，這種GSIS增強作用更加明顯，但濃度過高時，14增強GLP1(9-36)NH2效果的能力消失，甚至變為抑制作用，而化合物19即便在高濃度（10μM）時，也能強烈刺激大鼠胰島中的GSIS現象。且該實驗在低葡萄糖濃度下不存在促胰島素反應。
圖2.?化合物19的合成路線(A), 14和19功能性測定的劑量反應曲線(B)和及GSIS分析(C)
圖片來源JMC
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GLP-1R中配體結合模式假說
使用處于活性構象中的肽激動劑與全長GLP-1R的X射線復合物結構（PDB code：5NX2），得出了3,4,5,6-tetrahydro-1 H -1,5-epiminoazocino[4,5-b]吲哚骨架的結合假設，由于缺乏共晶結構和GLP-1R突變體，這僅是一個可以說明作者進行配體優化的理由，不能排除該系列其他潛在結合方式。在對接分析中觀察到文中系列化合物與正構口袋重疊的區域：(1) 配體在添加截短的肽GLP1(9-36)NH2時表現出正變構作用但在完整GLP-1(7–36)NH2存在下，氨酸His7-Ala8靠近變構位點，阻止了配體進入該區域;?(2) 只有通過使ECD與截短的GLP-1肽衍生物和7TM結構域接觸，才能激活GLP-1R;?(3)結合位點假說允許我們在空間上適應作者的配體系列。對于化合物9，誘導契合對接得出了與SAR一致的假設。叔丁基可能位于Leu388旁邊，環外配體酰胺氧可能與對GLP-1結合親和力至關重要的Arg190相互作用。二氟環己基可能位于Tyr241附近的疏水口袋中。哌嗪酮酰胺可能與Gln234和Met233相互作用，后者是肽結合的重要殘基。吲哚可能位于靠近Trp306和Arg380的上口袋區域?；衔?4和19與GLP-1R的結合模式與化合物9類似，其中，19的羧酸可能與Lys197的側鏈接觸。
圖3.通過誘導契合對接，化合物9與GLP-1R的X射線結構的結合模式
圖片來源JMC
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化合物19的體外ADME和體內藥代動力學分析
基于化合物19在體外藥理實驗中令人鼓舞的表現，作者評估了其ADME性質，以評估其在體內研究中作為工具化合物對概念驗證（PoC）的潛力?；衔?9在人和小鼠肝微粒體中代謝穩定，并且在Caco-2 TC7細胞轉運實驗中表現出高細胞通透性。此外，該化合物不抑制CYP3A4，顯示出良好的水溶性，并且在包括GSH和小鼠血漿在內的不同條件下化學穩定。在小鼠肝細胞中，19的中間清除率為0.145（mL/h）/106個細胞，相當于肝血流量的20%。作者利用過表達人類有機陰離子轉運蛋白hOATP1B1和hOATP1B3的HEK293細胞進行了轉運蛋白研究，用根據內部化合物和數據構建的2D-QSAR模型成功預測了19與OATP1B1和OATP1B3的相互作用，并且19也被分類為P-gp的底物。
在利福平的存在下將化合物19應用在ob/ob小鼠中的概念驗證研究，這是公認的T2DM疾病模型。在所有使用的模型中，在沒有利福平和/或GLP1(9–36)NH2的情況下，單獨的化合物19均未顯示對血糖濃度的任何影響。在肽GLP1(9–36)NH2的所有測試劑量下，化合物19在oGTT期間均引起血糖濃度的顯著劑量依賴性降低。這正好支持了作者的假設，即該正變構調節劑19的藥理作用是其直接與GLP-1受體產生相互作用。
圖4. 化合物19化合物19被鑒定為hOATP1B1和hOATP1B3轉運蛋白的底物(A)和其體內藥代動力學分析(B)
圖片來源JMC
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總結
本文利用高通量篩選和分子建模以及體內外實驗驗證的方法，開發了一類含有新骨架的胰高血糖素樣肽-1受體的有效正向變構調節劑，并對這系列化合物進行結構優化，合成和藥理學評估。其中，化合物19在各項功能測定中均顯示出高活性和選擇性，該PAM能將活性顯著降低的代謝物GLP1(9–36)NH2轉變為有效的配體，該配體能夠以與活性GLP-1肽本身相似的方式激活GLP-1R，為2型糖尿病的治療尋找到一類新穎的GLP-1R小分子激動劑的骨架。
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參考文獻
Mendez M, Matter H, Defossa E, et al. Design, Synthesis, and Pharmacological Evaluation of Potent Positive Allosteric Modulators of the Glucagon-like Peptide-1 Receptor (GLP-1R). J Med Chem 2019.
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