全新Nsp1/SL1復合物結構的解出，首次揭露了Nsp1如何進一步通過招募40S核糖體來識別自身RNA進而參與翻譯調控的方式，有助于開發新冠藥物及減毒疫苗。
與其他冠狀病毒(α-、β-、γ-和δ-冠狀病毒)相似，SARS-CoV-2是一種包膜、單鏈、正義RNA病毒，已知可感染大量脊椎動物。SARS-CoV-2的基因組編碼多達14個開放閱讀框(ORFs)。ORF1ab編碼了很多病毒蛋白，參與病毒形狀或結構形成的結構蛋白負責感染宿主細胞，非結構蛋白則通過與宿主細胞間蛋白的相互作用參與其他細胞內的病毒運輸。其中一個重要蛋白是非結構蛋白1(Nsp1)，在大多數感染人類的冠狀病毒中，包括SARS和MERS，Nsp1被證明是病毒復制和翻譯調控所必需的。它通過兩種方式攻擊宿主mRNA：通過阻斷核糖體的40S亞基來終止宿主蛋白的翻譯，或在宿主mRNA的5’UTR附近進行內切，使其不能翻譯。然而，由于Nsp1和病毒RNA在5’UTR區域的獨特的結構性相互作用，病毒RNA對這種切割具有抗性。雖然近年來有關Nsp1在阻斷宿主核糖體方面的報道較多，但有關SARS-CoV-2中Nsp1如何識別病毒RNA的關鍵區域（5‘UTR’）的機制尚不明確。另一方面，Nsp1在抑制宿主防御成分(如I型干擾素干擾素γ、白介素)的產生方面也發揮關鍵作用，它作為被感染細胞分泌的關鍵信號分子，可以提醒其他細胞病毒進入。
Nsp1在宿主細胞抗病毒防御機制(調節干擾素應答)中發揮了關鍵作用，并改變固有免疫系統，有利于病毒復制和免疫逃避，是一個潛在的治療靶點。澳大利亞莫納什大學的Wilma Jerom Lopes團隊通過酶動力學及分子動力學明確了SARS-CoV-2的Nsp1和5’UTR之間的分子相互作用和復合物結構穩定性并通過對接等計算模擬手段探討了潛在的抑制劑結構。
文章摘要圖。圖片來源于：JPCL
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首先，作者使用在線比對工具Clustal Omega對SARS-CoV-2、SARS-CoV-1和MERS的5’UTR區域進行的多序列比對(MSA)證明了三者的相似性，推測可能存在相似的物理結合模式。接下來，作者使用兩個獨立的程序:SPOT-RNA和RNAfold 以理解完整的5’UTR的二級結構特征。
已有實驗證實SARS-CoV-1和MERS的5’UTR的10-28號核苷酸與Nsp1相互作用。作者結合MSA，分別使用RNAComposer和simRNA程序對SARS-CoV-2的5′ UTR-SL1區域(7-33號核苷酸，以及延伸區域)的三維結構建模，初步分析二者可能的結合位點。隨后，作者再次使用Clustal Omega進一步分析SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS之間的Nsp1蛋白序列的相似性和差異性。結果發現SARS-CoV-2與SARS-CoV-1的相似性高達84.4%，與MERS的序列相似度僅為17.7%，表明SARS-CoV-2的Nsp1其結構、功能、及物理和化學結合特性與同一分支的SARS-CoV-1相同，很可能與MERS不同。這暗示著可以用SARS-CoV-1的晶體結構作為同源模板來構建穩健的和經驗證 (能量最小化和物理結合力優化)的虛擬SARS-CoV-2 Nsp1全長結構。作者以低分辨率的SARS-CoV-1 NMR結構為模板，使用SWISS-MODEL和I-TASSER從頭建模。已經發表的SARS-CoV-1的Nsp1的部分結構以及Nsp1-FL結構的RMSD為0.38，說明了氨基酸端結構域總體結構的準確性。再輔以觀察結果對SARS-CoV-2 Nsp1的RNA結合活性進行實驗測試，強調其物理上的相互作用。
不同分支的病毒Nsp1同源物對不同RNA片段(莖環區域)結合的親和力具有一定的范圍，一些依賴于核苷酸長度而另一些具有序列特異性。同時，SARS-CoV-2 5’UTR區域的哪個RNA片段與Nsp1結合尚不清楚。SARS-CoV-2和SARS-CoV-1的Nsp1在表面電荷分布上具有最高的同源性，文獻中同源蛋白SL1與Nsp1結合數據，結合文章的序列比對結果，作者試圖利用酶遷移位移分析(EMSA)來評估SARS-CoV-2的Nsp1和RNA的SL1區域之間的潛在相互作用。如預期，體外翻譯的5’UTR的SL1 RNA片段直接的、物理結合于Nsp1，全長純化蛋白的親和力較好，為0.18μM (圖1A,C)。進一步證明SARS-CoV-2 Nsp1直接結合于病毒RNA的SL1區域。隨后，研究者使用C端截短的Nsp1（1-133）（Nsp1△C）來測試其與相同RNA片段之間的親和力，探索C端結構域對RNA結合的必要性。實驗結果表明，Nsp1△C與SL1之間的親和力降低近一倍，為0.31 μM，且在摩爾濃度比為1:2時結合趨于飽和(圖1B,C)。Nsp1△C形成的RNA/蛋白符合物的拖尾更少，這可能是因為截短的形式更穩定，因為連接于linker區域的C端結構域高度柔性，可能導致結合親和力較低。?
圖1. SARS-CoV-2的Nsp1/SL1 RNA復合物的結構、表面電荷分布和親和力的EMSA計算。圖片來源于：JPCL
為了更好地理解SARS-CoV-2 Nsp1和SL1之間相互作用的結構和分子模式，作者使用分子動力學和基于選擇性對接和計算模擬進行了虛擬結構研究。作者分別使用ModelX、MDock和HADDOCK 2.4進一步驗證和精確對接復合物以明確二者之間的結合模式和相互作用。綜合HADDOCK分數、可重復聚類規模、RMSD以及結合自用能（氫鍵、范德華力以及離子相互作用），選擇可能的最佳模型。再使用Coot對該模型進行了驗證及修正，以確保殘基占據在最佳Ramachandran區域。隨后將最后的對接復合物結構與初始的Nsp1單獨模型結構進行比較，它們的Cα（中心碳原子）的總體RMSD為0.32 ??。這表明對接時沒有大的構象變化。
對接的Nsp1-RNA復合物結構顯示Nsp1以一種類似拍手（clap-like）的方式直接與SL1 RNA結合(圖1D-F)，其中兩個長的反平行β片界面位于SL1的RNA螺旋之上。還觀察到Nsp1誘導了RNA的物理彎曲(14.3°)，這可能有助于增強相互作用獲得更高的親和力。SL1的頂端/loop環區朝向N端和C端一側(圖1F)。此外，使用PISA服務器計算，Nsp1在SL1 RNA的結合創造了一個大的約943 ?2的掩埋界面（burried interface）。這表明5’UTR的Nsp1和SL1 RNA之間存在真正的緊密相互作用，功能結合研究也證實了這一點(圖1A,B)。
另一方面，Nsp1/SL1復合物的表面電荷分布表明，大多數RNA結合在蛋白質的正電荷區域(圖1G-I) 。C端區域包含一個帶負電荷的表面，其相關性最小，且遠離RNA結合槽，觀察到的Nsp1的正電荷區域以及其以拍手樣方式與凹槽/口袋結合和實驗結合研究證明了Nsp1對其翻譯調控的病毒RNA識別模式。
隨后，作者仔細研究了在Nsp1和SL1之間形成相互作用的關鍵殘基(圖2)。從復雜的結構可以明顯看出，RNA分子插入到Nsp1蛋白的溝槽狀結構中，在參與相互作用的殘基中，T12、Y118、R124、K125、N128、K129、L141和D147與SL1 RNA形成氫鍵, 而Nsp1的其他幾個殘基與RNA的距離很近，產生強烈的離子相互作用。特別的是，帶正電的長鏈Arg和Lys氨基酸殘基（K11, R124、K125和K141）插入到RNA溝槽(圖2)，與RNA的負電磷酸骨架建立起強大的離子相互作用，因此導致如圖1A,C中所見的更高親和力。此前關于SARS-CoV-1的研究也通過實驗表明R124和K125在病毒RNA識別中起著關鍵作用，這與作者在復合物結構中觀察到的及其他參與相互作用的潛在殘基一致。隨后作者通過突變實驗對結合自由能的影響從側面驗證了關鍵殘基。動力學實驗表明，野生型Nsp1結合于SL1 RNA的自由能為-68 kcal，大多數突變體的與RNA的結合親和力明顯降低。其中，Y118、R124、K125和K141上的突變表現出2 ~ 3倍的親和力減少，表明與突變蛋白的物理相互作用減弱或中斷。這進一步證實了Nsp1與RNA的真正結合親和力和有效性，并強調了在Nsp1/SL1-RNA復合物中參與這種物理相互作用的關鍵氨基酸殘基。
?圖2. Nsp1/SL1復合物之間詳細的氨基酸相互作用及Nsp1單一氨基酸突變對結合自由能的影響。圖片來源于：JPCL
為了驗證Nsp1-SL1 RNA復合物的整體復合物結構和實時行為，作者使用LARMD進行10 ns的分子動力學模擬。利用DynOmics服務器進行了B因子要素以及結構域分離分析和結合模擬研究，并使用Schrodinger分子動力學同步驗證。結果表明Nsp1 – SL1 RNA復合物在相互作用和動態運動方面是穩定的(圖3)。最重要的是，Nsp1-SL1 RNA復合物的殘基間接觸圖譜顯示，即使在動態或溶液狀態下，分子之間也存在清晰而穩健的物理相互作用(圖3A)。在動態狀態下，復合物之間至少有七個特定區域是穩定的，其中復合物被允許振蕩到7.3 ?。復合物中所有殘基的B因子值均低于0.5 ?2(圖3C)，進一步證明了配合物的物理穩定性較好。Nsp1-CTD的B因子分數的增加與大結構域的移動直接相關，這可以促進Nsp1-CTD插入40S核糖體RNA結合通道。Nsp1-CTD在該區域的結合對宿主的翻譯調控和Nsp1介導的免疫逃逸起著至關重要的作用。作者隨后試圖通過域分離動力學來檢驗Nsp1和SL1-RNA的域分離可能性。如圖3D,整個復合物構成的區域和Nsp1的N段區域觀察到十分小的特征向量，特征向量的得分分別為0±0.01和0±0.027，這表明復合物具有高穩定性和最小的物理分離可能性。
圖3. Nsp1/SL1復合物的結構穩定性研究。圖片來源于：JPCL
抑制或阻斷Nsp1的功能對調節病毒復制的治療有多個意義。但目前通過計算研究的藥物特異性極低，缺乏利用SARS-CoV-2的Nsp1-FL阻斷RNA相互作用功能的潛在和特異性藥物的結構和功能分析。根據抑制劑的化學性質，Nsp1處表面電荷分布及觀察到的RNA和Nsp1的結合模式，作者首次通過對接Nsp1-FL篩選了具有高結合潛力的抑制劑(圖4)。甘草酸、?肺衣酸、藤黃酸和替拉扎德能以更高的親和力與Nsp1結合，并在結構上阻礙Nsp1和SL1之間的物理相互作用。潛在Nsp1抑制劑間相互作用是由幾個極性、疏水和鹽橋相互作用介導的。候選藥物和靶標RNA具有相同的結合區域，且以高親和力結合。經計算，這些藥物與Nsp1-FL的結合△G值在-10.4 ~ -8.6 kcal/mol范圍內。這表明，這些藥物可能通過抑制Nsp1與SARS-CoV-2基因組5’UTR的SL1的相互作用，或抑制與任何其他目標宿主或病毒RNA的相互作用而發揮作用。?
圖4.可能阻止Nsp1/SL1復合物形成的潛在藥物。圖片來源于：JPCL
在疫苗開發方面，已有研究表明，小鼠肝炎病毒的Nsp1上的部分突變能產生減毒病毒，此外，SARS-CoV-2 Nsp1的精準結構和機制及其與病毒RNA和核糖體的相互作用將為探索開發減毒活疫苗打開思路?？赡芘c針對脊髓灰質炎病毒的Sabin疫苗的開發相似，在5’UTR區域的突變導致病毒翻譯的失效，從而引導目前脊髓灰質炎疫苗的開發。由于Nsp1也物理且直接的結合于其病毒RNA的5’UTR區域，其5’UTR區域或SARS的Nsp1可能的突變也具有使病毒弱化的能力，這可能有助于疫苗的開發。這一策略可用于開發SARS-CoV-2疫苗。作者設計了Nsp1/SL1復合物在翻譯調控中的潛在作用的示意圖以供疫苗開發人員參考。
圖5. Nsp1/SL1復合體潛在作用的示意圖。圖片來源于：JPCL
參考文獻
Vankadari N, Jeyasankar NN, Lopes WJ. Structure of the SARS-CoV-2 Nsp1/5′-Untranslated Region Complex and Implications for Potential Therapeutic Targets, a Vaccine, and Virulence. J Phys Chem Lett. 2020 Nov 19;11(22):9659-9668. doi: 10.1021/acs.jpclett.0c02818. Epub 2020 Nov 2.