文章概要
光轉化熒光蛋白?(PCFPs)?能隨激發光波長地改變發出不同顏色的熒光，這類熒光蛋白極大地促進了活細胞超高分辨顯微成像技術(PALM)的發展及應用。光轉化熒光蛋白(PCFPs)的光轉化機理一直是許多實驗和理論研究的熱點，對于PCFPs的光致變色和紅光閃爍都得到了廣泛的研究，但其綠光物理行為卻很少受到關注。然而，在顯微鏡成像中，發現綠色PCFPs中的暗態會變得非常密集，并且會間接地影響到紅色通道中記錄的數據質量。此外，PCFPs中的綠態光開關可直接用PALM，已被設計成高效可逆的光開關熒光蛋白?(RSFPs)。本文作者研究了綠色熒光蛋白mEos4b的發光機制，證明mEos4b和大多數RSFPs一樣，依賴于熒光生色團可逆的順反異構實現暗態和亮態之間的切換。然而，綜合結晶動力學、分子動力學模擬和拉曼光譜的結果，作者發現綠色mEos4b中的暗態比關閉綠色IrisFP（一種雙光色PCFP）中的暗態更為動態。數據表明，綠色PCFPs和RSFPs中的發色團在它們的亮/暗態狀態下保持的氫鍵模式共同控制著光開關量子產率。因此，與IrisFP相比，綠色mEos4b中動態暗生色團維持的H鍵數目的減少，很大程度上解釋了其較低的開關對比度。
研究內容
RSFPs的光開關是其關鍵的性能參數，在很大程度上決定了RSFPs可達到的分辨率。因此，評價RSFPs中控制開關對比度的機制具有重要意義，作者對綠色mEos4b的光開關進行了研究。綠色mEos4b中長壽命的暗態研究結果如圖1所示，其中暗態形成的特征（圖1A）是陰離子發色團的吸收帶衰減，峰值在504nm，質子化發色團的吸收帶上升，峰值在390nm。為了探討綠色mEos4b與長壽命暗態形成相關的機制，作者使用結晶動力學方法研究它們的開關行為，作者獲得了一個2.4?的暗態mEos4b晶體，并將所得的結構（灰色）與綠色熒光狀態下的mEos4b（綠色）進行了比較，電子差密度圖顯示出明顯的構象變化，表明生色團發生了順反異構化（圖1B）。綠色mEos4b中伴隨暗態形成的結構變化與綠色珊瑚蟲RSFPs中的結構變化基本相似（圖1C、D），如dropa、pcdropa、IrisFP和mTFP0.7，這表明，盡管容納反式發色團的空間有限，但都發生了類似的光開關機制。Ser142在順式狀態下與羥基芐叉部分建立一個強的H-鍵，一旦發色團異構化，就朝向周圍的溶劑并在Glu158中找到一個補償的H-鍵（圖1D）。在反態發色團的質子化可以用靜電環境相對于順態的變化來解釋。
在IrisFP中，Phe173Ser單點突變誘導Met159的重新定向，在發色團羥基芐叉環上方形成一個空穴，極大地促進發色團異構化。有趣的是，在mEos4b中是沒有這樣的口袋，但也可以發生異構化。因此，作者進一步研究了這種PCFP如何在反式結構中維持發色團。首先，作者注意到，與IrisFP相比，Glu144與發色團羥基芐叉部分的羥基之間的距離延長了（3.5?vs 2.9?），并且由該基團形成的唯一氫鍵涉及一個水分子（WAT403，2.5?），水分子被Gly155、Glu144和Thr175緊緊地固定在原位。這造成了發色團與Glu144之間的相互作用減弱。此外，與IrisFP相比，保守的Glu212未與發色團的咪唑啉酮結構形成H鍵（圖1D）。最后，與IrisFP（分別為?4°、40°和125°）相比，暗態時mEos4b中的發色團似乎采用了更高的傾斜和扭轉二面體（分別為?25°、52°和130°）。全局精細化進一步支持了這一假設，即亮態結構以穩定的氨基酸構象為特征，而暗態發色團及其環境中構象比較多樣化（圖1E，F）。另外，值得注意的是，順式構型中緊密結合的三聯體Glu144?His194?Glu212被反式構型中的Glu144 ?Arg66?Glu212三聯體取代，His14或Arg66分別通過與羥基芐叉部分的π-堆積和π-陽離子相互作用來穩定發色團（圖2）。
圖1. 對綠色mEos4b中長壽命的暗態研究
圖片來源JACS
圖2. mEos4b亮態（左）的Glu212-H194-Glu144和暗態（右）的Glu212-Arg66-Glu144之間的氫鍵模式
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為了探索這種動態發色團在綠色mEos4b暗態（稱為green off ）中的機理基礎，作者進行了MD模擬，并將結果與IrisFP的結果進行了比較。由于IrisFP是四聚熒光蛋白，作者對四條鏈都做了研究，晶體中每個鏈都能觀察到兩種不同的Ser142構象。在圖3中，作者顯示了最具代表性IrisFP構象的結果，值得注意的是，在mEos4b中，觀察到暗態時發色團的傾斜和扭曲二面角有很大的變化，在兩個主要亞態之間有躍遷（圖3A）。這些轉變在IrisFP中看不到，這表明在mEos4b中有一個更靈活的生色團，與周圍的氨基酸和水分子有松散的連接，可以靈活地發生順反異構。值得注意的是，由mEos4b的MD模擬得到的傾斜角和扭曲角的平均值低于從發色團的精細X射線結構中提取的值。作者嘗試性地解釋這一發現，因為后一種結構可能代表了多個平面構象的疊加。事實上，分子動力學模擬表明，mEos4b生色團在兩種呈現不同H鍵模式的主要構象之間快速切換（圖3B）。在第一構象（62%）中，羥芐叉氧（O3）與Glu144保持氫鍵，而在第二構象中，該鍵斷裂并被與水分子（W1）的氫鍵取代。因此，O3交替地將其質子傳遞給Glu144或W1。在IrisFP的情況下，類似的MD模擬顯示了O3將其質子傳遞給Glu144的高度優勢構象（90%）。在mEos4b中，兩個主要生色團構象之間的轉換發生在幾納秒的時間內。然而，放大1ns的時間間隔（圖3B，插圖）顯示，氫鍵斷裂也發生在較小的時間尺度上，從幾皮秒到幾百ps。有趣的是，羥芐叉氧水平上的H鍵構象開關與傾斜和扭曲二面角的變化相關，如圖3A、B所示。
根據在晶體結構中觀察到的氫鍵三聯體Glu144?Arg66?Glu212（圖2），在所有mEos4b和IrisFP模擬中，Glu144?Arg66氫鍵都穩定存在。然而，Arg66-Glu212鍵的情況并非如此。在mEos4b中，Arg66（NH2）－Glu212（OE2）相互作用只存在41%的時間，而在IrisFP中，它幾乎一直被破壞，水分子在模擬過程中一直介導著兩個伙伴之間的相互作用。在IrisFP中，Arg66（NH2）與His194建立氫鍵，這導致兩種蛋白質在發色團的咪唑啉酮結構周圍的氫鍵模式不同。在IrisFP中，發色團的N15原子在86%的模擬時間內與Glu212相互作用（圖3C）。此外，咪唑啉酮氧（O25）在43%的時間內保持與水分子的H鍵，此外還保持與Arg91的穩定H鍵。相反，在mEos4b中，咪唑啉酮部分除了與Arg91形成氫鍵外，沒有其他氫鍵。
總體而言，MD模擬清楚地表明，與IrisFP相比，mEos4b中的暗態發色團不太穩定，這與基于晶體數據的細化結果一致。mEos4b中發色團在暗態下的動力學性質可與發色團口袋相鄰殘基所建立的氫鍵數目減少有關。在分子動力學模擬過程中，作者統計了羥芐叉氧、咪唑啉酮氧和咪唑啉酮氮（分別為O3、O25和N15原子）所建立的氫鍵的平均數目，mEos4b為2.5，而IrisFP為3.5。相比之下，從靜態晶體學結構中提取的氫鍵數量分別為3.6和6.6（有關氫鍵計算的說明，請參見支持信息中的材料和方法）。這些更高的數字，尤其突出了H鍵相互作用的瞬態性質，這在X射線結構中是無法解釋的。在mEos4b中發色團的弱錨定有助于在光激發時返回到亮態，因此解釋了該PCFP相對較高的反向開關量子產率和較低的開關對比度。
圖3. 暗態下的綠色mEos4b和IrisFP分子動力學模擬結果對比
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在mEos4b的紅色狀態下，作者觀察到一種類似的涉及發色團異構化的光開關行為，在相應的暗態（稱為red off）中，發現了一種所謂的“受挫”發色團，根據晶體數據，這種發色團的無序性甚至比在綠色暗態（green off）更大。兩個暗態結構的疊加如圖4所示。有趣的是，這兩種結構之間的差異僅僅是由于Phe61的主鏈斷裂和由光致變色引起的擴展電子共軛，而發色團綠色和紅色mEos4b的環境基本保持不變。在Red off中，發色團的酚基與Glu144之間的距離現在大于4.2?，這表明發色團完全失去了與Glu144的相互作用，這個作用在IrisFP穩定存在，在mEos4b的Green off中短暫出現。相反，發色團只能與水分子形成氫鍵。然而，Red off中保持了咪唑啉酮結構的氫鍵。因此，紅色mEos4b中暗態的高動態性質可能不僅與連接發色團和β-桶的H鍵模式有關。更需要注意的是，與Green of f相比，Red off中主鏈斷裂和氧化還原速率的擴展共軛也會導致發色團維持的靜電相互作用的顯著變化。例如，Green off的Arg66和發色團之間的π-陽離子相互作用在Red off被阻斷，而是由另一個Arg91殘基承擔了該角色。除了氫鍵，靜電相互作用也有助于發色團的穩定性，并在很大程度上決定了開關能力，作者推測發色團在mEos4b的Red off的動態性質是由弱氫鍵和靜電相互作用的組合而來，這也可能是迄今為止在設計快速開關的紅色RSFPs時遇到的困難有關。
為了研究不可逆光轉換和可逆光開關對mEos4b基態結構動力學的影響，作者進一步收集了其綠色和紅色以及相應的暗態拉曼光譜（圖5）。值得注意的是，Green off 和Red off的拉曼光譜寬度顯著增加（圖5B）。作者將這種增加歸因于暗態中的高動態發色團。值得注意的是，作者還發現綠色和紅色mEos4b的低pH拉曼光譜也顯示出增加的帶寬，盡管幅度較小。這表明，通過光照或降低pH值使發色團質子化是失穩的主要原因。?
圖4. 綠色和紅色mEos4b中暗態的比較
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圖5. mEos4b的拉曼特征
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結論
本文的工作提供了PCFP復雜光物理的擴展圖，并強調了由于生色團順反異構化和質子化受阻而導致的mEos變體的顯著的雙光變色特性。這些數據揭示了發色團的顏色狀態對可逆光開關的微妙影響，并指出綠色和紅色mEos4b中光開關狀態的高度動態特性。熒光蛋白的生色團的一個固有性質是在光激發。盡管熒光蛋白支架具有剛性，但這種異構化永遠無法完全阻止，并最終形成反式發色團，而反式發色團可能被抑制，同時由于順式和反式之間的高自由能壘（由異構化過程中的空間位阻引起）。作者推測，控制綠色RSFPs開關對比度的最重要因素之一是順反態的相對穩定性，特別是通過每個態中發色團維持的H鍵數目。這一推測與超快速光譜實驗一致，該實驗強調了氫鍵相互作用如何控制細菌色素團的發色團異構化量子產率。比如，在Dronpa上進行的量子力學/分子動力學模擬也顯示了對發色團構型的明-暗光開關更有利，其特征是低數量的氫鍵相互作用。由于開關量子產率與s1電子激發態的微觀開關速率有關，因此它們的對數將隨s1與路徑過渡態之間的吉布斯自由能差ΔG*而定。如果在RSFP的亮、暗態下，H鍵通過提高或降低s0和s1的自由能對ΔG*有顯著的貢獻。圖6A收集了所有PCFPs和RSFPs的數據，測量了它們的綠色亮、暗態下的結構和相應的開關量子產率，盡管進行了粗略的簡化，但可以觀察到整體顯著的相關性，這一事實表明，在RSFPs中，氫鍵確實是控制開關量子產率的關鍵因素。如圖6B和C所示，作者展示了一個擬議方案。與IrisFP相比，在兩個方向上，mEos4b的暗，亮之間的躍遷勢壘更高，這與mEos4b中較小的開關量子產率和較慢的熱恢復一致。與IrisFP相比，mEos4b異構化過程中的空間位阻更大，這可能是后者中Phe173Ser突變的結果。然而，由于暗態自由能相對于亮態自由能的增加，在mEos4b中，暗-亮開關的速率相對于亮-暗開關的速率要高得多，主要歸因于mEos4b暗態下氫鍵相互作用的數量較少。總之，本文的工作破譯了在綠色mEos4b中起作用的主要開關機制。如本文所提出的，發色團和周圍蛋白質殘基之間的氫鍵模式在控制光開關中的關鍵重要性，最近也證明了靜電相互作用的作用。在這兩種相互作用的驅動下，生色團對于未來新型PTFPs的合理設計具有重要意義。?
圖6. RSFPs的生色團氫鍵與光開關量子產率之比之間的關系
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參考文獻：
Zitter E D , Ridard J , Daniel Thédié, et al. Mechanistic investigations of green mEos4b reveal a dynamic long-lived dark state. Journal of the American Chemical Society, 2020, DOI: 10.1021/jacs.0c01880