NAR | 通過二級結構設計穩定mRNA的理論基礎

背景介紹

信使RNA (mRNA)分子已顯示出在當前COVID-19大流行中作為候選疫苗的潛力，并已成功研發出mRNA疫苗。然而RNA水解會對mRNA疫苗的制造、儲存、運輸以及藥效的方方面面造成影響。因此，有必要探索如何設計mRNA分子以提高其穩定性。一種減少RNA水解的設計方法是增加RNA分子中二級結構的程度。雙鏈區域的存在可以減緩水解，保護內聯切割和酶降解，同時編碼相同的蛋白質。

本文作者報道了一個理論框架和計算模型，表明結構感知設計能夠快速且顯著地穩定COVID-19 mRNA疫苗。作者提出了一個將RNA分子的總體水解率與堿基配對概率聯系起來的原理模型，并定義了兩個指標：分子未配對概率的總和（SUP），和平均未配對概率（AUP，它是由序列長度標準化的SUP）。該模型中，越小的AUP意味著越高的穩定性。

圖1. mRNA序列以及優化設計。圖片來源：NAR

RNA降解的生物物理模型

以往通過預測mRNA最穩定結構的折疊自由能來評估其穩定性，但尚不清楚這是否是提高RNA抗降解穩定性的正確指標。作者基于RNA降解的原則模型，提出了一種替代的指標。RNA水解的速率是每個核苷酸處于未配對狀態的平衡概率的一個特性，這使得其3’磷酸二酯鍵容易采用內聯攻擊構象。作者假設配對或未配對核苷酸的降解速率遵循一級動力學(類似于為結合結構探測數據而開發的模型)，引入SUP作為一個容易計算的可觀察對象，直接與RNA分子的整體分裂率有關。

對于長度為N的RNA分子，SUP定義為

參數Punpaired(i)可以在最廣泛使用的RNA二級結構預測包中進行預測，預測包可輸出堿基對概率p(i: j)，堿基對i與j配對的概率。

解離的總速率可以近似為SUP乘以常數kcleavage unpaired（kcleavage unpaired反映了一個未配對核苷酸的平均解離率）：

AUP定義為：

推導出：

AUP值是一個介于0和1之間的數字，它反映了RNA的整體“非結構化”及任何二級結構基序中的未配對區域占的比例。較低的AUP值對應較低的未配對概率，RNA分子較不容易降解。在這個模型下，可以通過計算來研究一個RNA被重新計算形成穩定的二級結構后能穩定的程度。

SUP優化序列與密碼子優化序列或

最小折疊自由能優化序列之間存在差異

為了研究mRNA降解期限可能的動態范圍，作者從mRNA設計問題開始，選擇了一組短肽標簽進行評估（圖2）。為了估計通過結構獎勵設計可能實現的穩定性改善的范圍，作者計算了從商業網站獲得的常規設計mRNA序列的平均值與標簽蛋白的最小AUP溶液之間的AUP比值，發現AUP變化范圍為1.27 ~ 2.23倍。在作者的模型中，這意味著穩定性的顯著增加。

圖2. 短肽標簽蛋白評估結果。圖片來源：NAR

作者探索了這種穩定性改善是否可以通過例如LinearDesign和CDS-fold等算法實現，這些算法優化了一個不同的度量，即最小自由能結構△G(MFE)的預測折疊自由能。對于多個模型系統，能量最低的MFE結構的編碼序列與最低AUP的解決方案并不相同(圖2A)。而最小AUP解決方案的“熱點”少于最小自由能解決方案（圖2B），證明了如果希望減少整體水解，較低的AUP會是首選標準。

對于長mRNA結構，AUP可以達到兩倍的降低

隨后作者測試了長度為數百個核苷酸編碼各種目標蛋白的mRNA，以測試更現實的蛋白編碼mRNA設計問題的適用性。作者進一步開發了一種隨機蒙特卡羅樹搜索算法RiboTree，以隨機最小化模型mRNA的AUP。

此外，對比在線RNA設計平臺Eterna上的Open Vaccine挑戰的眾包結果，作者在“p(unp)挑戰”中請求額外的Eterna序列，即計算AUP指標并在游戲界面中提供給Eterna參與者以指導優化。

圖3A中描繪的結構表明了低AUP結構的視覺特征: LinearDesign、CDSFold、RiboTree和Eterna的結果具有更長的螺旋，更少的環和連接，莖中的未配對概率更低(圖中暗紫色)。在所有挑戰中，AUP最小的解決方案與△G(MFE)最低的解決方案不同(圖3B)。表2包含了由標準方法（密碼子取樣、基因供應商工具）分離的設計方法和旨在穩定二級結構的方法(Eterna AUP理性設計、CDSfold、LinearDesign、RiboTree)的AUP值的匯總統計。

圖3. ?Eterna眾包設計。??圖片來源：NAR

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表1. 不同設計方法對mRNA設計挑戰的AUP值比較。?表格來源：NAR

在“p(unp)挑戰”中，Eterna參與者提交的AUP值顯著低于標準方法，且其最低AUP值均低于從LinearDesign、CDSfold，或RiboTree獲得的AUP值。RiboTree解決方案表現出較低的AUP，但不一定最小化△G(MFE)。作者指出在不減少△G(MFE)或△G(ensemble)的情況下，最小化AUP可能被證明是一種有價值的設計策略，用于開發儲存穩定、但又需要一定的不穩定性以實現其翻譯過程中功能的mRNA。

與翻譯和免疫原性功能相關的特性的多樣性

在確定了用低AUP設計mRNA序列的可行性后，作者希望確定這些序列是否可以翻譯，以及預防或引發先天免疫反應。

作者發現，低AUP的mRNA設計(圖4A)具有與高翻譯效率一致的密碼子適應指數值（CAI）。圖4B、C分別顯示了編碼序列的前14個核苷酸未配對的概率范圍(AUP^init,14)，螺旋長度不超過33 nt，這表明它們不太可能提高先天免疫反應從而關閉細胞mRNA翻譯。

圖4. 與翻譯和免疫原性功能相關的特性的多樣性分析。圖片來源：NAR

作者同時對所設計序列的最大階梯距離(MLD)進行了表征，以定量評價結構多樣性。這種測量方法被用來描述病毒的基因組RNA的緊密性，并被猜測與病毒包裝、免疫原性和生物持久性有關。作者注意到，對于AUP較低的序列，MLD值仍然在很大范圍內（圖4）。除了MLD，作者還計算了其他一些表征結構的指標，如不同類型環路和連接的數量。在所有情況下，在低AUP結果的中值范圍超過2倍，強調了可獲得的結構的多樣性。

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Eterna的參與者能夠設計出

穩定的SARS-CoV-2全長spike蛋白mRNA

對于較長的mRNA設計問題，包括COVID-19疫苗中使用的SARS-CoV-2刺突蛋白mRNA配方(3822 nts)，作者注意到與AUP相關的計算熱動力學集成相關的計算速度變得緩慢，阻礙了由AUP指導的自動化或交互式設計。因此，為了尋求其他更快速計算的可觀察到的結果，作者計算了許多可觀測值與AUP之間的相關性，發現單個MFE結構中未配對核苷酸的數量與AUP的相關性最大，并利用這一觀察結果在Eterna中推出了另一個設計思路: 將MFE結構中最小化未配對核苷酸的數量作為AUP的替代以設計疫苗。

盡管JEV +spike mRNA的長度是之前挑戰的4倍多，但Eterna參與者仍能夠找到與之前挑戰相同的AUP值，且最佳AUP低于自動化方法實現的最低AUP。

在大多數疫苗配方中使用的SARS-CoV-2刺突蛋白序列是一個雙脯氨酸突變體S-2P，它穩定了spike蛋白的預融合構象。作者啟動了Enterna的最后一個謎題，要求找到編碼S-2P的穩定mRNA的解決方案。Eterna社區投票選出的解決方案在保持低AUP值的同時顯示了結構的多樣性，AUP最低的解決方案在結構上與LinearDesign的△G(MFE)優化結構相似(圖5A)。不同設計方法的AUP值在不同的mRNA長度上是一致的。通過將“標準”設計方法改為增加結構的設計方法，AUP降低了2倍，相當于mRNA半衰期增加2倍(圖5B)。?

圖5. SARS-CoV-2的全長Spike蛋白的穩定mRNA設計。?圖片來源：NAR

?在一些設計環境中，采用現有的高度穩定的mRNA設計而不是從頭設計mRNA是有利的。作者發現，從低AUP解決方案中得到的預測穩定性，不論是當在更高的溫度下計算時、在其他折疊算法中計算時，還是存在添加的UTR和蛋白質序列的小變化時，都是穩健的（圖6）。

圖6. 低AUP結果作為超級折疊mRNA。?圖片來源：NAR

小結

本文介紹了通過基于結構的設計開發的一個穩定mRNA抗體外水解的框架。模型將RNA分子的降解速率與mRNA的平均未配對概率(AUP)聯系起來。將傳統mRNA設計方法的AUP優化和通過Eterna平臺上的OpenVaccine挑戰的眾包結果進行比較發現，對Eterna的理性設計和更復雜的算法會導致低AUP結構，更不易降解，稱之為“超級折疊”mRNA。這些設計顯示了廣泛的序列和結構特征的多樣性，可能是翻譯和免疫原性所需要的。此外，優化過的結構對溫度、計算機建模方法、側翼非翻譯區域的選擇和靶蛋白序列的變化具有較強的穩定性。mRNA半衰期增加至少兩倍似乎是可以實現的，這可能是mRNA生物技術的重大改善。

參考文獻

Wayment-Steele HK, Kim DS, Choe CA, Nicol JJ, Wellington-Oguri R, Watkins AM, Parra Sperberg RA, Huang PS, Participants E, Das R. Theoretical basis for stabilizing messenger RNA through secondary structure design. Nucleic Acids Res. 2021 Sep 14:gkab764. doi: 10.1093/nar/gkab764. Epub ahead of print. PMID: 34520542.