通過QM/MM分子動力學模擬和同位素標記實驗，作者發現在倍半萜SdS合成酶中去質子化-再質子化序列可以通過G1/2 helix這段保守結構域的主鏈羰基結合1分子水的催化來實現。
簡介
萜類合成酶可以催化自然界最為復雜的環化串聯反應，為自然界最大的一類天然產物提供骨架分子。很大一部分的萜類環骨架的生物合成需要經歷碳正離子中間體去質子化失活和再質子化重新激活的串聯過程，這一串聯過程極大地豐富了碳正離子中間體的結構形態，與萜類天然產物的結構多樣性密切相關。然而，人們對酶在去質子化-再質子化序列過程中所起到的作用知之甚少。一直以來，研究者們致力于在酶活性口袋中尋找催化該過程的堿性和酸性蛋白殘基，但至今仍無確切答案。
近日，暨南大學藥學院王永恒副研究員和德國波恩大學Dickschat教授等聯合在Nature子刊Nature Catalysis上在線發表了題為“Catalytic Role of Carbonyl Oxygens and Water in Selinadiene Synthase”的研究論文。運用QM/MM分子動學模擬，作者發現在倍半萜SdS合成酶中去質子化-再質子化序列可以通過一段保守結構域G1/2 helix的主鏈羰基結合1分子水的催化得以實現，而實現這一過程所涉及的立體化學得到了同位素標記實驗的證實。
圖1. 酶如何提供堿性/酸性殘基參與到去質子化-再質子化序列中。圖片來源：Nat. Catal.
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圖2. 底物反應構象推測。圖片來源：Nat. Catal.
主要內容
通過分析產物的絕對構型，作者推測出兩種可能的底物反應構象（exo和endo，圖2），然后利用酶蛋白晶體結構建立了兩種可能構象的酶-底物復合物全原子模型。通過分析底物態的QM/MM分子動力學軌跡，作者發現這兩種構象的底物與酶的作用方式有很大的區別。exo-底物的兩個烯基氫與G1/2 helix兩個殘基Asp181和Gly182的主鏈羰基分別形成氫鍵作用，這拉近了合環原子之間的距離，說明這些主鏈羰基有識別底物構象的作用（圖3a）。
進一步的計算與模擬表明，exo-底物可以形成穩定的合環中間體(10R)-A+，而且能量上更為有利；另外，Gly182的主鏈羰基能通過靜電作用穩定關鍵合環中間體(10R)-A+，從而確定了exo為底物的反應構象。
圖3. SdS酶催化關鍵結構。圖片來源：Nat. Catal.
分析中間體(10R)-A+的結構，作者發現H10與Gly182的羰基氧能形成穩定的氫鍵作用，于是推測Gly182的羰基很可能起到堿的作用，對中間體(10R)-A+的C10位進行去質子化（圖3b）。繞C10-C11鍵旋轉的勢能面掃描表明，只要C1、C9、C12和C13近似共平面，H10就能自發地轉移到Gly182的羰基上形成去質子化的中性中間體GB，而且順時針旋轉在能量上更為有利。同位素標記實驗也表明該過程發生了繞C10-C11鍵的順時針旋轉。所以，理論計算和實驗都支持Gly182的主鏈羰基作為去質子化的堿。
由于在中間體GB的C6位附近沒有合適的殘基可以提供質子重新激活底物（圖3c），作者認為先前質子化的Gly182最適合充當酸的角色，但是由于其距離較遠且朝向不適合的質子遷移，所有嘗試均以失敗告終。幸運的是，仔細分析QM/MM分子動力學軌跡，作者發現在去質子化的過程中，酶活性口袋中有1分子水正逐步向Gly182靠近（圖3a, 3b, 3c），于是推測該水分子很可能介導質子遷移，實現底物的重新激活。
該假設得到了計算與模擬的支持，而同位素標記實驗表明激活底物的質子確實來源于水分子，立體化學也與計算的結果相吻合。因此，Gly182的主鏈羰基在去質子化-再質子化序列中同時扮演了堿和酸的角色，而活性口袋中的1分子水起到了介導質子遷移的作用。
結論
本文利用QM/MM分子動力學模擬結合同位素標記實驗，解決了萜類酶催化領域的一大機制難題?酶是如何直接干預去質子化-再質子化序列的，并揭示了該過程的許多催化細節。在這一過程中，酶蛋白主鏈羰基同時扮演了堿和酸的角色，具有啟發意義：或許人們在這一問題上尋找答案的方向是錯的，催化去質子化-再質子化序列的并不是常規的堿和酸。這或許是這一問題長期未得到解決的原因。這份研究打開了研究萜類生物合成中去質子化-再質子化序列催化細節的一扇大門，為其它萜類環化酶的研究指明了方向。
參考文獻
1. Yong-Heng Wang, Houchao Xu, Jian Zou, Xian-Bo Chen, Yu-Qing Zhuang,?Wei-Liang Liu, Ersin Celik, Guo-Dong Chen, Dan Hu, Hao Gao, Ruibo Wu, Ping-Hua Sun?and Jeroen S. Dickschat,?Catalytic Role of Carbonyl Oxygens and Water in Selinadiene Synthase, Nature?Catalysis, 2022,?accepted. DOI: 10.1038/s41929-022-00735-0.