Nat. Commun. | 螺旋結構基序可用于功能性肽設計

背景介紹

蛋白質的二級結構賦予了其一種特殊的機械性能，特別是α-螺旋，可以介導各種類型的分子功能，包括細胞膜穿透、亞細胞定位、分子內/分子間變構，特殊螺旋DNA框架、以及蛋白質-蛋白質相互作用等。

功能肽的系統設計具有良好的治療應用前景?，F有的數據庫如蛋白質二級結構數據庫(PSS)不再服務于社區，而蛋白質二級結構字典(DSSP)則在提供蛋白質三級結構時才對二級結構進行注釋。因此，作者從PDB中提取了約170萬個螺旋，并將其編譯成一個數據庫(治療肽設計數據庫：TP-DB)。本文展示了該數據庫的三個應用：識別已知的純化標簽特異性抗體、設計一種新的抗菌肽（AMP），以及提示螺旋肽阻滯劑的點突變。

TP-DB界面

數據庫特性和統計數據

TP目前由1,676,117個螺旋肽組成，從130,000個以上的實驗解析的蛋白質結構中提取。作者設計了兩個指標來評估和優選多肽——HP和接觸分數。更高的HP和/或更低的接觸分數表明肽的單獨形式具有很好的螺旋性。標準化的HP，HPNA定義為HP_a.a./NA_a.a.，其中HP_a.a.為給定的氨基酸類型的HP，NA_a.a.是氨基酸的天然豐度（表1）。HP_a.a.和NA_a.a.為概率，HP_a.a.定義為TP-DB中某種氨基酸類型的分數，NA_a.a.則是ExPASy工具“ProtScale”工具中同種類型氨基酸的分數。相關肽的上述數據的對數值總結于表1。

第二個度量是平均接觸分數，定義為氨基酸的總數，由它們的Cα原子表示。在其親本蛋白中，一個螺旋的接觸數較低，這表明它在獨立地保持螺旋形式的可能性較高。只有高度接觸的螺旋在如此高的接觸穩定時才能形成。

表1. HPa.a.及NAa.a相關數據結果。表格來源：Nat. Commun.

TP-DB搜索引擎的構建

作者建立了一個不考慮序列同源性的基于模式的搜索引擎，并針對TP-DB的數據結構進行了定制。匹配特定模式的螺旋肽首先在數據庫中進行索引。一種模式是“Y***G**K”的形式，其中“*”屬于20種氨基酸中的任何一種，酪氨酸(Y)、甘氨酸(G)和賴氨酸(K)被稱為該模式的“錨定殘基”。模式的位置由PDB ID、鏈ID和模式在該鏈中開始的位置進行索引。組成模式為[A₁mA₂nA₃]，其中A₁、A₂和A₃是氨基酸的單字母編碼，兩者之間由整數m和n表示的間隔, m和n的范圍是從0到4?！癥3G2K”或其搜索模式[Y 3G 2K]表示“Y”是G上游的（3+1）殘基，K上游的（2+1）。一個鍵與標識符（值）配對，指的是在所有存儲的多肽段中都可以找到這個鍵的位置(圖1c，e)。這些值存儲在一個數組中，是肽標識符和每個肽中某個鍵的所有起始位置(圖1c)。這些鍵-值對組成了TP-DB數據庫（圖1），可以通過簡單的模式[A₁mA₂nA₃]或由這些簡單模式組合的模式來搜索(圖1f)。

要查詢數據庫，用戶需要指定至少三個錨定殘基和分隔它們的間隙，例如“ADE”或“K***VA”可以分別用 [A 0 D 0 E]和[K 4 V 0A]搜索(圖1d)。對于更復雜的查詢，如“A/Y 3 G 2 K 3 H 4 K”(組氨酸：H)，它首先被分解為兩個子查詢“A 3 G 2 K 3 H 4 K”和“Y 3 G 2 K 3 H 4 K”的組合(圖1f)。每個子查詢中的五個錨定殘基被視為兩個連接的三錨定鍵。在返回結果之前，進一步解析肽序列中共定位的匹配模式以考慮重疊區域。TP-DB目前有兩個搜索引擎來搜索索引的肽段，一個是通過上面描述的模式搜索，另一個是通過BLAST。

圖1. TP-DB的肽段索引和查詢。圖片來源：Nat. Commun.

Anti-FLAG抗體被重新用于病原體診斷

為了解釋搜索引擎在沒有考慮殘基進化相似性時發現模式的效用，作者需要確定匹配查詢模塊的序列是否只能通過其TP-DB工具查詢到。作者演示了一個純化標簽(FLAG-tag)及其抗體（M2抗體）可被重新用于檢測人類病原體的診斷試劑盒的案例。已知FLAG-tag有一個序列DYKDDDDK，其模式D-Y-K-x-x-[DE]被實驗證實為主要的親和決定基序。

當對TP-DB查詢“D0Y0K2D/E”模式時，可以識別出完整的93個序列和唯一的19個序列。同時使用PHI-BLAST搜索NCBI的非冗余蛋白序列(nr)，不能查到任何E-value＜100的序列。另外，在19個TP-DB鑒定的序列中，在幽門螺桿菌菌株26695中發現了含有序列“DYKYLE”的HP-NAP。如果anti-FLAG M2抗體能夠識別這個隨機選擇的致病蛋白，則可以使用相同的概念，將任何已知的抗體和抗原識別基序的原始用途作為其替代用途。如預期一樣，通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA；圖2a)和免疫印跡法(WB，圖2b)分析，發現anti-FLAG M2抗體確實能夠識別HP-NAP。進一步分析顯示，M2抗體與HP-NAP上含有Arg77到Glu116殘基的多肽片段結合，該多肽片段中存在抗原識別基序DYKYLE。

因此，純化試劑盒的抗體(以下簡稱M2抗體)可以重新用于檢測人類病原體的診斷試劑盒，文中為幽門螺桿菌檢測，通過ELISA識別天然HP-NAP或通過WB識別17 kDa條帶處的NAP單體。

圖2. 用抗FLAG M2抗體檢測HP-NAP。圖片來源：Nat. Commun.

α-螺旋AMP設計

泛耐藥細菌對人類健康有重大威脅。以細菌脂質膜為目標的AMP的進化速度比細菌蛋白受體要慢得多，似乎是一種很有前途的抗生素替代品。作者使用TP-DB進行了相關的研究。首先通過MD模擬詳細研究了之前報道的兩個AMP螺旋（W3_p1和W3_p2）的插入過程，以了解每個殘基在細菌膜插入過程中的物理化學作用，肽穿透脂膜越深，它所能具有的殺菌能力就越高。以W3_p1為例，將結果展示在圖3。通過微秒模擬作者發現，這些AMP插入細菌膜，嚴重依賴于與兩個氨基酸等量間隔的三個色氨酸錨點，是插入的必要條件。?

圖3. 1μs MD模擬揭示了W3_p1插入細菌膜的機制細節。圖片來源：Nat. Commun.

作者從已知的螺旋AFP/AMP作為設計模板開始進行AMP設計?；诂F有的模板和關鍵的錨定殘基，使用TP-DB取代了其中三個等距色氨酸(W3、W6和W9)兩側的殘基，以找到功能有利的取代基，并確保具有所需的二級結構。使用TP-DB中的輸入查詢模式“W**W**W**W”或[W2W2W]作為搜索查詢。

肽“WKCWARWRL”(C:半胱氨酸)具有最多的正電荷殘基和相對較高的HP，被列為首選。該肽來自結核分枝桿菌鋅依賴金屬蛋白酶-1，是一種不與膜結合的可溶性蛋白。添加了兩側的雙賴氨酸殘基以擴展這個基序成為一個成熟的AMP候選。新設計的 AMP命名為 W3_db5，然后由MD模擬進行分析并合成用于后續殺菌實驗。

對比模板的MD模擬結果發現，在1 μs 模擬結束時，W3_db5 只有一個 Trp (W3) 插入細菌膜。隨后，作者檢測了其在能抑制90%的細菌生長時的最小抑菌濃度（MIC₉₀）。新設計的AMP W3_db5的抗真菌MIC₉₀為3.75 μg/mL，比W3_p1 和W3_p2的效果好兩倍以上，但在抑制細菌的能力上，MIC₉₀弱于W3_p1 和W3_p2，為30 μg/mL，在細菌抑制能力上的結果與MD模擬結果一致。

表2. ?AMP體外藥效結果。表格來源：Nat. Commun.

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盡管新設計的W3_db5與其母本的抗菌活性相似，但是其毒性更低。W3_db5的溶血性至少比W3_p1和W3_p2低20倍。表2中的AMP的最小溶血濃度MHC₅測試也展現出了類似的結果。

圖4. W3_p1、W3_p2和W3_db5的溶血百分比與AMP濃度的關系。圖片來源：Nat. Commun.

含有W3_db5中這種強效拉伸“WKC WAR WRL”的原蛋白(結核分枝桿菌鋅依賴金屬蛋白酶-1)不是跨膜或膜結合蛋白;螺旋拉伸的位置接近但不完全暴露在水-蛋白界面。因此，TP-DB能將結構解析的元素組合在一起，匹配所需的模式，為了治療方案的理性設計，這里則展示了一種距離其起源有6個點突變新的AMP。從設計的角度來看，這 6 個點突變似乎并未明顯改變所需的插入熱力學，W3_db5仍然可以穿透肽聚糖，到達脂質-水界面，保持兩親性和螺旋狀，并最終插入細胞膜。這很難通過突變實驗或 MD 模擬在沒有TP-DB的指導下實現。

隨后作者發現從TP-DB中提取的序列在單獨存在時比其他方法（比如PHI-BLAST）獲得的相似序列更具螺旋性。圓二色譜數據顯示（圖5），搜索獲得的三個AMP中，W3_db5螺旋度最高，W3_n1最低，且W3_n1的螺旋度最接近Tat（一種流行的細胞穿透肽，具有隨機螺旋結構）。

圖5. 變化范圍為190~260nm的CD譜。圖片來源：Nat. Commun.

設計針對致瘤性PPI的肽抑制劑

表1中的統計數據顯示，丙氨酸仍是點突變的安全選擇，同時仍然保持螺旋的完整性。然而，使用基于模式的搜索引擎在TP-DB中的可及性，可以通過選擇TP-DB建議的殘基，在螺旋中進行點突變，以消除或者增強其余確定藥物、多肽或者蛋白的相互作用，并且仍然保持螺旋的螺旋性，以及能在結構生物學家對一個酶及其同源底物進行共結晶的情況下，取消α-螺旋上殘基的催化功能，同時保持其與某些底物或配體的結合親和力。

總結

TP-DB搜索引擎首次讓在引入突變以獲得功能的同時確保所需的二級結構成為可能。本文演示了如何通過TP-DB設計一個新的螺旋AMP，且隨后驗證了其能抗真菌和細菌，并通過圓二色譜驗證了其高螺旋度。除此之外，TP-DB還可用于設計螺旋-肽阻斷劑，以防止致瘤性蛋白-蛋白相互作用。TP-DB的出現加速了功能肽設計的過程。

參考文獻

Tsai CY, Salawu EO, Li H, Lin GY, Kuo TY, Voon L, Sharma A, Hu KD, Cheng YY, Sahoo S, Stuart L, Chen CW, Chang YY, Lu YL, Ke S, Ortiz CLD, Fang BS, Wu CC, Lan CY, Fu HW, Yang LW. Helical structure motifs made searchable for functional peptide design. Nat Commun. 2022 Jan 10;13(1):102. doi: 10.1038/s41467-021-27655-0. PMID: 35013238; PMCID: PMC8748493.