JMC | 機器和自動化時代的藥物化學：連續流技術的最新進展

背景介紹

藥物化學在化學生物學、藥理學和藥學研究中發揮著基礎性和潛在性的作用，以此用于發現安全有效的藥物。小分子藥物化學依賴于由化合物設計、合成、測試和數據分析組成的迭代學習循環，為全新的和成藥性靶點提供新的化學探針和先導化合物。然而，使用傳統的方法，從初設到得到結果的時間可能會延長，從而限制了可以進入臨床研究的化合物的數量。這一挑戰可通過利用在改進藥物發現過程中顯示出巨大潛力的技術來解決，例如，連續流系統、自動化和生物測定等。在此，意大利學者在下文中對以上技術進行了概述。

藥物化學演變和進化：

缺點和技術解決方案

藥物化學是一門集化學生物學、藥理學和醫學于一體的交叉學科，在藥物發現中發揮著重要作用。藥物化學的主要目標有：(i)發現尚未研究的生物靶點的化學探針和先導化合物；(ii)證明靶點的成藥性；(iii)解決決定藥物研發成功或失敗的核心問題。最重要的是，藥物化學能夠識別臨床候選藥物，并提供新的策略，據此來提升靶點-和先導-發現階段的范圍和質量，盡管這些階段常常被低估，但它們對減少藥物發現過程中的損耗至關重要。事實上，大多數藥物的失敗是由于缺乏療效和安全性，這可能與靶點和/或先導化合物系列的化學結構有關。

因此，選擇哪個系列的先導藥物是影響藥物發現成功率的關鍵。然而，從多種可能性中找到正確的系列仍然很困難。近三十年來，人們提出了許多解決這一問題的方法，如基于組合化學(CombiChem)和多樣性導向合成(DOS)的平行化學探索方法，同時，預測模型的精度也越來越高。盡管取得了一些進展，但就時間和成本而言，確定新的先導物仍然是一項極其復雜和繁重的任務。據估計，對于每一種通過批準的藥物，平均需要大約20個靶點-到-先導物的探索和15個先導物優化項目，成本約為6億美元(占新藥開發總成本的32%)(圖1A)。因此，加快早期藥物的發現是一個長期存在的問題，它需要多模式的方法和創新的解決方案。

直至1980年，關于生物靶標及其對疾病機制的影響以及它們潛在的治療應用的信息還非常有限。由于缺乏快速的體外篩選能力，化合物通常設計并以克為單位單獨合成，以滿足動物模型試驗材料的要求。鑒于當時有限的方法和工具，這些合成通常是耗時并伴有風險的，而且效率很低。每周的輸出產物很少，所以用于鑒定先導物的化合物庫也非常有限。這些缺陷使得發現過程異常緩慢，然而成果的取得主要還取決于研究人員的直覺和創造力，甚至是來自于偶然的發現。隨著時間的推移，這種化學-激發/藥理學-驅動的方法已經在生物-激發/技術-驅動的過程中得以進化。高通量篩選(HTS)、計算建模以及最近的人工智能(AI)和學習機器(ML)的出現，使大量化合物的快速設計和評估成為可能。內部化合物收集的體外篩選和虛擬篩選活動可以揭示不同類別的活性化合物(hits)，這些活性化合物經過化學修飾，可以提供具有改進性質的類似物(leads)。因此，在化合物吞吐量和可擴展性方面擁有強大的合成能力對于滿足對化合物測試的持續需求至關重要。

此外，藥物化學定義的結構-活性關系(SAR)的迭代學習過程包括計算設計、化合物合成、生物測定和數據收集，而這些分析將會驅動下一個學習周期的展開(圖1B)。典型的，周期階段是劃分的，延遲是復合性、貫穿始終的，從假設到結果，經過緩慢的探索，到最后有限的化合物用于臨床試驗。

綜上，研究者在此討論了杰出的科學家對自動化流系統發展的貢獻，以及他們對藥物化學和藥物發現的影響。研究者重點關注一些范例，這些范例展示了流技術在自動合成化合物收集方面的應用，可用于篩選以及閉環策略，突出了機器人和機器控制作為獨立平臺的潛力。對流動設備、分析設備、自動化工具和生物分析的概念、整合策略以及描述同樣進行了闡述。

?圖1 (A)藥物發現早期階段的成本和時間。(B)基于不同學科活動的藥物化學迭代學習周期，舉例說明1980年以前(藍色)、2000年以前(橙色)和現在(紅色)使用的關鍵方法。

自動化流系統助力藥物化學：

概念和設備

早在上世紀60年，固相肽合成就已實現了自動化。目前，自動的HTS篩選化合物庫已經成為制藥公司和學術實驗室的常規工具。其他應用包括化合物存儲庫、高通量實驗(HTE)、并行/組合合成、決策支持系統、虛擬篩選和分子設計。

在化學和生物學中，適當的自動化已經成為創新發現過程的重要驅動力，提高的效率同時，也降低了成本和時間。針對化合物集合的目標篩選是相對低成本、快速和極其有用的，尤其是在確定靶點化合物系列的優化階段。然而，HTS活動的效率取決于化合物的可用性和合成。純化合物的制備通常被認為是藥物化學的一個限制因素，因為實驗化學是一個勞動密集型和費時的工作。因此，化學合成與提純分析的自動化、并行化、一體化，對于保證持續、快速的純化合物供測試、提高重復性和降低成本(與人工、連續化合物合成相比)至關重要。

圖2 集成流控工作流程用于自動分子設計、合成、篩選分析、優化迭代藥物化學發現循環。

因此，合成和相關技術的自動化在先導物和藥物發現方面發揮了核心作用，因為它們可以提供解決方案來克服當前的局限性。目前，基于機器-輔助-流的方法不僅增加了適合自動化的化學成分，而且提升了效率、安全性并減少了對環境的影響。此外，反應步驟與下游過程的集成，如在線軟件輔助分析設備、預測計算工具和反饋控制，可以實現合成和藥物化學過程的流線化(圖2)。例如，ML合成平臺與化學人工智能(CAI)的集成，將徹底改變化學家設計和發現新分子的方式，特別是在與實時篩選相結合的情況下。這種方法很吸引人，但實現完全集成的平臺仍然非常具有挑戰性，目前，只有制藥公司和少數領先的學術研究小組可以做到。

流合成器

流合成器的使用，是批量化學理想地補充或替代，因為它具有以下幾個優點：

1. 精密控制。流合成器可以更準確地控制反應參數(包括濃度、溫度、壓力和反應時間等)，這可以為轉化更高的產品質量提供更可靠的方法，同時在制造工廠減少碳足跡。流動反應經歷了有效的混合和傳熱/傳質，對反應速率和生產力有有利的影響，而設備的增壓允許操作在過熱條件下擴大反應窗口。

2. 安全。流合成器確保了危險或惡臭物質的密封和危險的化學轉化的傳導。在整條生產線上，流合成器與下游設備的集成、自動化和在線反應監測可以進一步減少手動操作和操作人員的風險，同時還適用于可伸縮和多步合成。

基本的流裝置可以通過回收高效液相色譜和氣相色譜儀器的部件(例如，泵或泵的一部分、連接器、油管、注射閥、自動取樣器和餾分收集器)自行組裝。計算機輔助設計(CAD)和3D打印技術的使用，使得現在允許自制定制的混合元素、停留時間循環、分離單元、芯片和反應器的特定流應用。對連續流化學的興趣高漲也導致了相對簡單、用戶友好和商業上可獲得的模塊化流設備。

典型的流動裝置由可互換和重復布置的模塊組件組成，從而產生多種可適應的組合和設置。不同模塊之間的連接使用油管和非濕潤部件，即螺母和鐵套管，用于將油管連接到各自的單元。管材的尺寸、幾何形狀和材料類型必須根據工作系統壓力、化學相容性和需要，進行適當的選擇。一般來說，對于低壓和中壓(< 30 bar)惰性全氟聚合物是合適的，而高壓工藝則需要更堅固的材料，如不銹鋼。根據流量、系統壓力和反應溶液的性質，可以使用不同類型的泵來精確地將起始物料和試劑送入流系統，包括高效液相色譜泵、注射器泵、蠕動泵和旋轉泵(圖3)。高效液相色譜泵可用于流量大于0.1 mL min-1的低和高壓設置，盡管可能會與揮發性溶劑泵發生故障。對于低壓方案中較低的流量，注射泵可以確保更好的控制。這些泵由兩個獨立的注射器組成，其中一個將預先規定的液體輸送到系統中，而另一個則同時進行灌裝。無論是高效液相色譜泵還是注射泵，泵送系統都是與液相直接接觸的，因此可能會由于試劑不相容、污垢或沉淀而造成損壞或中斷。一旦出現以上問題，蠕動泵可作為在高流量和低壓(最高可達10-15 bar)，同時懸浮-良好的泥漿下泵送的替代品。此外，旋轉泵也是一種選擇：它們可以在比蠕動泵更高的壓力下工作，并被賦予比HPLC裝置更大的化學和機械阻力。

試劑可以直接從泵送到系統中，也可以預先裝入樣品回路中。第二種情況下，樣品回路通過六路注入閥連接到流系統，并可以與自動取樣器相連接，實現自動試劑輸送。通過泵的動作，通過T-形或Y-形連接器或精心設計的用于高反應性轉換的微混合單元混合后，反應物流被泵入反應器(圖3)。反應發生在芯片、線圈和填充床反應器中，這些反應器的工作溫度通過熱電偶、低溫裝置、微波輻射和感應加熱技術緊密變化(圖3)。反應器類型和材料的選擇取決于反應的性質和反應物。

基于芯片的反應器是由硅、玻璃、陶瓷或不銹鋼制成的，盡管存在生產速度較低和潛在的堵塞問題，但其保證了對質量和傳熱的更好控制。線圈式反應器由不同外徑和內徑的氟聚合物(聚四氟乙烯[PTFE]、全氟烷氧基烷烴[PFA]和氟化乙烯丙烯[FEP])或不銹鋼制造。這兩種類型都可以通過光透明材料實現光化學反應。最近，管中管反應器、光化學反應器和電化學反應器已經商業化，可用于進行光化學、電化學和氣體反應。最后，填充床反應器是理想的多相催化劑或固體載體的試劑。玻璃、聚合物和不銹鋼柱或筒可與固體材料包裝，以進行多相催化或清除樹脂的粗提純?；貕赫{節閥(BPR)是一種特殊的閥門，可以保持系統壓力恒定，允許在過熱條件下工作，同時解決在常規批處理方法下可能出現的安全問題。此時，反應流可以在收集或進入下游操作前進行分析，包括通過膜或重力分離器進行液體/液體分離、色譜(模擬移動床色譜)、溶劑切換、在線蒸發、結晶和蒸餾。

圖3?流動化學設備的范例

過程分析技術

FDA已將過程分析技術(PAT)定義為通過及時測量影響關鍵質量屬性(CQA)的關鍵過程參數(CPP)來設計、分析和控制生產過程的系統。PAT包括大量的化學、物理和統計分析，以及各種分析測量，包括熱電偶、紅外、拉曼和紫外光譜、質譜、色譜、核磁共振、結晶監測以及粒子大小分析(圖4)。

使用PAT的過程控制可以應用于各種質量參數(質量取決于設計，QbD)的實時分析、多變量和同步評估，以及過程危害的優化控制。當與流技術集成時，PAT對于在大規模開發期間的伸縮合成、庫建設和流程優化的監控極為有用。在軟件的幫助下，PAT可以與下游裝置進行自動化合成，用反饋系統控制反應條件和優化代替篩選實驗。通過串聯合適的分析裝置，使反應混合物在離開反應器后進行分析，從而實現在線分析。此外，分析也可以通過使用開關閥和流體分流裝置進行采樣來進行在線和離線分析。樣品稀釋器、溶劑切換裝置和溶劑去除裝置可設置在取樣和分析之間。

根據研究過程的具體要求，目前有許多分析技術、工具和傳感器可用于流裝置(圖4)。其中，高效液相色譜(HPLC)和氣相色譜(GC)是最易于使用的技術，這是因為在大多數實驗室中都有離線版本，成本低，在可檢測的化學物質陣列方面通用性強，實施時間短。光譜學是PAT目前流體處理的首選方法，已被廣泛應用于化學轉化。光學傳感器及設備可以直接插入反應器內部或旁邊，從而避免了材料取樣。根據所需的靈敏度、選擇性和樣品穩定性，不同的光學光譜技術可以與流儀器相結合，包括紫外可見光譜、熒光光譜、拉曼光譜和紅外光譜(圖4)。流化學與高分辨率PAT檢測器的集成，如臺式質譜(MS)和核磁共振(NMR)，使能以高通量的方式對反應成分進行實時量化和識別成為可能。然而，與最常見的光學光譜和色譜技術相比，MS和NMR都更昂貴，且存在基質效應，因此在大多數情況下需要在分析前進行采樣，以避免不必要的干擾。

圖4 可用于連續流工藝的PAT的代表性范例。

計算工具和軟件

一個自動化的基于流的機器需要在計算工具和軟件的幫助下工作的。統計程序，如實驗設計(DoE)，進化，自我優化，或機器學習算法和基于云的系統都已經被證明是對藥物化學和有機合成應用有效的監控，管理和調整操作流程系統。除了簡單的試劑選擇的管理和化合物收集庫外，機器輔助流裝置還可以應用于在閉環模式下的藥物化學學習和過程優化的預測和決策行動。盡管這一領域仍處于起步階段，但最近的進展已經推動了不同的流設備制造商、研究小組和專業公司為自動化藥物發現平臺開發特定的軟件和編程語言。與此同時，用于自動化流系統的開源軟件和計算機輔助方法也在迅速發展，包括LabVIEW、MatLab、LeyLab、OpenFlowChem、ChemOS和Chemputer等套件。

LabVIEW(實驗室虛擬儀器工程工作臺)是1986年由美國國家儀器公司開發的一種圖形化編程語言，用于自動化控制和數據采集。圖形表示基于直觀的流程圖，由三個主要組件組成：一個前面板，它是一個包含輸入的模塊；一個框圖，它允許編輯代碼，將圖形化；以及一個連接器面板，作為連接的接口。這個看似簡單的網絡允許系統、驅動程序和桌面應用程序的集成和自動化，也可以通過多種方式實現遠程控制。這種編程語言，在過去的幾年里一直在更新換代，直到現在最新的19.0版本，包括大量的數據分析和過程控制功能，不同的代碼框架(如COM, .NET和共享DLL)，以及不同的通信協議(如RS232、GPIB和TCP/IP)。時至今日，LabVIEW已經在儀器控制、系統集成、機器人技術、自動化和數據庫等方面得到了突出性的作用。

MatLab是由Mathworks公司發布的一種開源軟件，支持可定制的高級數據分析。大量的工作已經證明了MatLab代碼和LabVIEW編程語言的有益集成，可用于實現反應篩選和優化以及藥物化學目的的自動化和完全集成的流程平臺。

2016年，Ley集團開發了基于物聯網概念的自動化流平臺—LeyLab，可通過TCP/IP協議實現用戶服務器和服務器設備通信，實現對其進行遠程控制和監控(圖5A)。該軟件具有通過因特網瀏覽器訪問的圖形界面、存儲與實驗和設備有關的所有信息和數據的數據庫、由不同代碼、協議和命令組成的通信模塊、以及包含針對單個設備的所有代碼定義和命令的命令模塊。利用該軟件性能，分別采用在線IR和MS分析，已對Appel反應和丁腈水化反應進行了多維優化(圖5B)。?

圖5 LeyLab的示意圖(A)和個案研究(B, C)。

此外，正如三個不同APIs的合成所演示的那樣，LeyLab允許在服務器的不同位置定位和控制設備(圖5C)。自優化的反應，其中包括合成(±)-曲馬多的格氏加成(1)；利多卡因胺環化和烷基化的方法(2)；制備(±)-丁氨苯丙酮的溴化/胺烷基化步驟(3)，都可在洛杉磯(CA，美國)使用劍橋(英國)的設備，通過位于日本的服務器監控和控制(圖5C)。

OpenFlowChem，是最近一個用于流程自動化、控制和監控的開源平臺，是為了簡化不同軟件之間的組合而創建的(圖6)?；贚abVIEW和云的數據傳輸，通過MatLab借助SNOBFIT算法進行優化，該靈活的平臺只需較少的編程工作，即可修改初始配置設置。OpenFlowChem平臺由可處理連接設備的設備監視器、提供儀器間集成的系統模塊和可選的外部安全裝置組成。

圖6 OpenFlowChem平臺的示意圖。

最近開發的ChemOS是一個通用、靈活、模塊化的軟件包，它結合和編排了自動化機器人平臺和AI算法。該平臺還支持設備的遠程控制和跨不同國家的實驗室并行進行實驗。ChemOS由六個模塊組成，包括：(i)與研究人員的互動；(ii)數據庫處理和管理；(iii)機器人技術；(iv)特征；(v)學習程序；(vi)分析。該系統的核心是學習模塊，它能夠在已有實驗結果的基礎上，自主、連續地提出新的實驗參數集。

圖7 Chemputer用于合成鹽酸苯海拉明(Nytol, 11)，西地那非(Viagra，12)和魯芬酰胺(Banzel, 13)的示意圖。

Chemputer是Cronin集團最近開發的一套軟件。雖然迄今為止Chemputer僅應用于圓底瓶化學，但該軟件能夠控制整個硬件模塊，并結合所需的單個操作單元，以完成所需化合物的實驗室規模的自動化多步驟合成?？删幊痰臋C器操作和化學過程包括加熱/冷卻系統，攪拌和泵操作的控制，添加和混合試劑，系統清洗和啟動，反應淬火，過濾和雙相液體萃取，Chemputer用于控制復雜的多步驟合成序列，使用從Reaxys數據庫收集的步驟，不需要任何的人為干預，并證實了其可用于鹽酸苯海拉明(Nytol, 11)、西地那非(Viagra，12)和魯芬酰胺(Banzel, 13)的合成。

生物驗證

流平臺與生物測定的結合提供了一個解決分隔和時空邊界問題的機會，減少了藥物化學循環中的閑置時間。此外，在線流量測試需要小容量(nL或pL)的測試解決方案，并已顯示改進的數據重現性。眾多研究已表明了與流系統兼容的特定生物測定法的發展，以及用于化學生物學研究的微流控芯片實驗室設備的創造。

圖8 使用熒光共振能量轉移(FRET)的均勻連續流分析的代表。

第一個研究可以追溯到2003年，當Hirata和合作者描述了由熒光共振能量轉移(FRET)組成的均勻連續流測定法，以測量在存在兩種抑制劑的情況下人體免疫缺陷病毒(HIV)蛋白酶底物1的水解，即4-(2-氨乙基)苯磺酰鹽酸氟(AEBSF, 14)和乙二胺四乙酸(EDTA, 15)(圖8)。HIV蛋白酶底物1與兩個染色體共價結合，即EDANS(供體)和DABCYL(受體)。該系統由泵、兩個超回路和聚四氟乙烯線圈反應器、一個帶有六端口注入閥的自動注入器和一個位于適當流量池內的熒光檢測器組成(圖8)。在優化條件下，將酶溶液(1 μg mL?1)和載體緩沖液(0.1 M磷酸鹽緩沖液、0.1 M氯化鈉和pH = 7.5時的0.05% (v/v)吐溫20)以25 μg mL?1的速度泵入第一個反應器圈。超級旋轉是安裝第一個注射器和線圈之間反應堆提供酶溶液進入系統，而六端口噴射閥的自動注射器放置在第二個注射器和注射抑制劑濃度位于0.25到7.5 mM溶液的第一個反應線圈之間。得到的結果加上的HIV蛋白酶底物(0.1-2 μM)在50 μL min-1進入第二個線圈反應堆。最后，最后，混合物洗脫到熒光檢測器以評估酶抑制和產生劑量反應活性(圖8)。微流體生物測定隨后通過插入在線偶聯與尺寸排除液相色譜(LC)技術實現，該技術有助于從非活性化合物中分離蛋白酶抑制劑抑肽酶和AEBSF(14)。

圖9 一種用于鑒定乙酰膽堿結合蛋白抑制劑的微流控共聚焦熒光檢測方法的發展。

2010年，Heus及其同事報告了一種新的方法，通過將在線納米-LC與發光二極管(LED)和毛細管共聚焦熒光檢測器耦合，可以最大限度地減少樣品和試劑的消耗。用連字符連接技術成功應用的識別乙酰膽堿結合蛋白抑制劑(圖9)，特別是含有乙酰膽堿結合蛋白的生物測定溶液(AChBP，1 μg mL?1)和(E)3-(3-(4-二乙氨基-2-羥基芐基烯) 3,4,5,6-四氫吡啶-2-基)吡啶(DAHBA, 16, 40 nM)熒光示蹤劑配體，由注射泵以5 μg mL?1的流量輸送，并與0.4 μL m?1泵送的納米-LC流出物在微型芯片(4 μL)中混合。在生化反應室中，DAHBA最終被納米柱中的潛在配體洗脫，從乙酰膽堿結合蛋白上取代，導致熒光下降。該檢測裝置由高強度LED燈、一系列激發和發射濾光片、共聚焦透鏡、二向色鏡、光電倍增管和泡孔毛細管組成。LED燈發出的光通過一個465 nm的單帶通濾光片過濾，用透鏡準直，通過二向色鏡反射90度進入泡池(520 nm)。隨后，發出的光通過同樣的二向色鏡、聚焦透鏡和一個520 nm的單帶通濾波器，最后被光電倍增管檢測出來。該檢測系統與梯度反相納米液相色譜相結合，在流注射分析模式和濃度響應方式下操作。綜上，這些設備的組合可以確定9種抑制劑的IC50值，對于每個與約為~100 pmol的化合物只使用10 nL。?

圖10 電化學反應池與連續流生物親和度測定和LC-HRMS分析的集成。

阿姆斯特丹大學的研究人員提供了一個優秀的概念證明，將連接的電化學反應細胞與連續流動生物親和度測定和LC-HRMS相結合，以確定和表征電化學轉化產物為p38α溶酶原活化的蛋白激酶抑制劑(圖10)。該系統由四個模塊組成：電化學反應池、LC系統、帶熒光檢測器的連續流生物親和度檢測單元和質譜儀。將激酶抑制劑的標準溶液溶解在適當的緩沖液(25% MeCN和75%的1mM水緩沖液)中，最終濃度為10 μM，用注射泵以5 μL min-1輸送。緩蝕劑在線電化學轉換后，擬合一個梯度LC柱對形成的產物進行分離。用柱后瓣膜通過p38α細胞生物親和試驗和質譜系統分離洗脫液。因此，將部分洗脫液(13 μL min-1)與p38激酶抑制酶混合，以50 μL min-1遞送，并直接進入反應圈進行酶結合。與此同時，利用Shimadzu離子陷阱飛行時間混合質譜儀(LC-IT-TOFMS)在線分析了電化學轉換(100 μL min-1)產生的第二次反應，以獲得結合劑的結構信息。最后，添加示蹤分子后，對酶進行檢測。熒光示蹤劑化合物允許快速表征新的p38α激酶抑制劑(圖10)。

最近，Patel和同事開發了一種微流連續流注射滴定法(CFITA)，用于監測凝血酶肽酶活性的抑制情況(圖11)。CFITA檢測設備基于四通道泵送系統，用于輸送酶、底物、緩沖液和被測化合物。特別地，凝血酶(0.4 nM)及其基質(17.6 μM)均使用特定的milliGAT LF泵以250 nL min-1的速度泵送，用于高精度流體處理。止回閥和適配器連接在泵的后面，以防止回流和減少油管直徑。將用含Cy5染料(500 nM)的緩沖液稀釋的被測抑制劑填充在六路注射回路中作為內標。因此，抑制劑滴定是通過將閥門從負載位置切換到注入位置開始的，同時，一個額外的泵將緩沖液以500 nL min-1總流量輸送到抑制劑通道中，以產生梯度。數字式流量計保證了對系統總流量的監控(1 μL min-1)。生物測定在不銹鋼板中進行，而光學儀器是由帶通濾波器共焦透鏡具有兩個勵磁(488/650 nm)和兩個發射(530/670 nm)二向色濾光片波長激光誘導同時勵磁模塊，和一組非球面共焦透鏡的基線校正。結果，為每個被測化合物生成了生物測定數據和梯度數據的階梯梯度滴定曲線。最近，這種流式生化分析方法已集成到環流控閉環藥物發現的流平臺中。

圖11 微流控連續流注入滴定法(CFITA)監測凝血酶肽酶活性的抑制。

最后，在合成生物學的應用中，包括DNA組裝、轉化/轉染、培養、細胞分選、表型測定、人工細胞和遺傳回路等方面，已有大量的液滴微流體測定的例子被報道，Gach等人最近對此進行了綜述。

自動化流合成和脫機化合物測試

在過去的幾年內，眾多研究表明利用可用于生物測試的化合物收集自動流合成是有利可圖的。值得一提的是，Djuric和AbbVie等人在2011年實現的系統，可能是第一個在自動化流態下產生不同種類化合物的全集成系統(圖12)。合成與集成流技術(SWIFT)，是基于一個Accendo ?Conjure流反應器，其集成了自動取樣器和制備高效液相色譜/設備(圖12)，可進行不同的化學轉化，包括酰胺鍵和尿素的形成，還原胺化反應，三唑合成的Huisgen環加成作用、親核取代，黃?；磻?，從而獲得高純產品。特別的是，該裝置能夠在10-20 mg的規模下合成由10-48個成分組成的不同化學庫，產量從23%到63%之間不等，平均每小時可合成6個化合物。2014年，使用三菱機器人(圖12)對SWIFT進行了進一步的補充，該機器人采集了整個過程的樣品到下一階段，包括合成、純化、樣品分配用于純度評估、蒸發和樣品制備用于篩選。

圖12 AbbVie的SWIFT系統示意圖。

最近，Perera和同事描述了如何將反應優化策略與化合物合成相結合，并在藥物化學環境中拓寬反應化學空間?；谧詣踊髌脚_進行了Suzuki?Miyaura反應與交叉偶聯產物合成的超快實驗篩選(圖13)。通過篩選不同的反應條件和組分(包括溶劑、催化劑和堿基)，該單個模塊單元得到了驗證，從而在不到4天的時間內生成了約6000個反應的信息。然后采用最佳條件制備了一毫克級的Suzuki?Miyaura環加合物，該加合物產率≥85%，且純度高。?

圖13 用于Suzuki?Miyaura反應篩選、優化和驗證的自動化流平臺。

接下來的案例，將展示用于合成和表征化學庫使用不同水平的自動化和離線生物評估的高通量流策略的發展。

2013年，Ley小組描述了一種自動三步流法合成咪唑[1,2-a]吡啶衍生物，包括GABA-A激動劑唑吡坦(17)和阿吡坦(18)，通過前沿親和色譜(FAC)測試白蛋白結合評估(圖14)。該程序包括使用管式和盤管式反應器、支持試劑和清除器、用于給藥的自動擴增器和分數收集器。在聚合磺酸樹脂的誘導下，乙醛酸乙酯(在PhMe中1.5 M)和苯乙酮類似物(在PhMe中1M)在120 ℃下反應25 min，開始合成。過量的乙醛酸可用負載芐基胺的清除柱清除。由自動進樣器以0.3 M濃度給藥純不飽和酮中間體，并在管狀反應器中與少量過量的不同氨基吡啶反應，反應器中充滿50℃加熱的MgSO4(圖14)。因此，在120℃的條件下，在盤管反應器內很容易形成Ketimines，粗混合物被酸樹脂連續純化。通過將酯部分轉化為酰胺和羧酸基團，進一步提高了庫的多樣性。結果，在4天內以10-70%的收率制備了22個咪唑[1,2-a]-吡啶類似物。人工或自動稀釋后，將合成的化合物通過含有固定化人血清白蛋白(HSA)的柱，以檢測FAC的結合活性(圖14)。除了測定的KD值與先前報道的唑吡坦(17)和阿吡坦(18)數據高度相關外，該方法可能對預測藥物血清蛋白相互作用有重要的實用價值。?

圖14 前沿親和層析法(FAC)檢測咪唑[1,2-a]-吡啶的自動流式合成和純化。

制備新型BRD9溴域抑制劑也采用了上述同樣的策略。尤其是，當3,6-二氯吡啶-4-羧酸(19, 0.25 M)在Et3N (1 M)，tBuOH (1.5 M)的存在時與二苯磷酰疊氮(DPPA, 0.375 M)進入中間體20的柯提斯重排反應，是用于制備氨基三唑吡嗪核(21)的器械，后來被用作合成結構相關類似物的構建塊(圖15)。采用遠程控制流動設備生成?；B氮中間體，并在兩個不銹鋼反應器中進行熱環化(120℃) (50mL, τ= 2.3 h)。一個在線壓力調節器保證氣體的控制過程中產生的反應，同時相比傳統的批處理程序具有更好的熱交換。最重要的是，不穩定的?；B氮中間體易于反應自主合成氨基甲酸酯20，產率為2 mmol h-1。接下來的步驟包括叔丁基羰基(BOC)的脫保護，三唑環的形成，鈴木交叉偶聯反應分批進行，從而生成6個BRD9溴域抑制劑。然后使用FAC-MS儀器對合成的化合物進行離線測試FAC-MS儀器是專為BRD9測定而設計的，由一個固定在鏈霉親和素包覆珠上的生物素化BRD9溴域的定制柱組成。因此，化合物22被確認為是最有效系列的模擬物，另外在FAC-MS中顯示了1167 μL的保留時間(Vret)和針對BRD9的熱穩定試驗+ 4.3的熱轉變(ΔTm)。此外，盡管比較少(Vret = 784 μL，ΔTm = + 2.4)，但化合物23顯示了對BRD4溴域有更好的選擇性(圖15)。?

圖15 通過前沿親和色譜(FAC)測定BRD9溴域抑制劑的自動化流合成和測試。

此外，自動化流控平臺還與全新的分子設計相結合，以驅動庫擴展和靶點優化的構建塊選擇。Schneider及其同事報告了第一個例子，他們將微流控合成與基于計算機的靶標預測結合起來，用于快速制備和測試咪唑吡啶基化合物(圖16)。

Ugi三組分反應在采用總體積為5 μL的硼硅酸鹽DeanFlow芯片、鋸齒形混合器和自動填充、稀釋、分配的電磁閥組成的流裝置中進行。初步篩選后的反應參數，反應是在泵送原液進行的，該原液由胺(0.3 M)、醛(0.3 M)、10%高氯酸在乙醇和異氰酸的乙醇溶液(0.3 M)組成的，總流量為15 μL min-1。因此，采用高效液相色譜法純化咪唑并吡啶12，分離收率在5% ~ 53%之間不等，純度≥95%。該系統與由ChEMBL數據庫中469個已知藥物靶點構建的高斯過程回歸模型相結合，獲得所有被測化合物對靶點的預測親和力。因此，研究者選擇了5個潛在靶點，包括腺苷受體A1和A2B、腎上腺素能受體α1A和α1B以及PDE10A進行進一步研究。通過放射性配體位移分析和基于細胞的功能活性測定從12個符合回歸模型預測結果的化合物中找出9個，化合物24和25是活躍在腎上腺素能受體的拮抗劑α1B (Ki = 2-3 μM)和化合物26顯示了對腎上腺素能α1A和腺苷A2B受體的拮抗劑配置(圖16)。

圖16 合成咪唑并吡啶的微流控平臺。

研究者最近報道了，作為新型孕烷X受體(PXR)激動劑的手性四環四氫喹啉的流合成、自動化、分析和計算工具的集成(圖17)。采用多組分Povarov反應在連續流動和自動化條件下，在3個工作日內快速合成了29個類似物。用手性高效液相色譜法完成了純非對映異構體的純化和立體化學賦形，采用含時密度泛函理論(TD-DFT)計算實現了硅電子圓二色性(ECD)分析。然后將純同分異構體通過AlphaScreen法鑒定可知：化合物27可作為PXR的低微摩爾激活劑(EC50?= 1.2 mol / μM)，有效率為119%?？偟膩碚f，該系統提供了一種理想的基于流的方法，用于發現和優化多組分化合物庫的自動生成和表征。所提出的工作流確實可用于具有相似自由度和原子的支架，以加快藥物化學和立體選擇性多組分方法的發展(圖17)。?

圖17 用于新型PXR激動劑的四環四氫喹啉類的自動化流合成、純化和分析。

端到端機器輔助發現

將自動化流合成與下游操作、PAT、生物測定和計算相結合，有可能實現最佳的發現周期時間。在小分子藥物發現中，閉合合成、自動化、藥物設計和數據分析之間的循環正在如火如荼地進行。

2005年，葛蘭素史克公司的研究人員報道了一項開創性的工作，旨在創建一個能夠集成合成和生物篩選的平臺(圖18)。他們制備了磺胺類藥物庫，并對T-細胞酪氨酸磷酸酶(TCPTP)進行了連續篩選。該設備由UHPLC泵送系統、微芯片反應器、自動采樣器、稀釋裝置、檢測系統和用于分析的LCMS組成(圖18)。?

圖18 用于自動化合成磺胺和T-細胞酪氨酸磷酸酶(TCPTP)抑制劑的在線生物篩選的集成流平臺。

硝基苯胺(0.6 M)與磺酰氯(0.6 M)在吡啶存在下反應后，通過LC柱，裂解成兩個樣品：一個用于紫外線/ MS檢測/分析，另一個用于熒光法在線篩選TCPTP的抑制作用。六分之三的磺胺類藥物分別在120和15 μM處表現出高達60%和25%的抑制作用。

2013年，Cyclofluidic公司與Sandexis LLP、Accelrys公司以及Sanofi-Aventis公司合作，設計了一個在算法設計(CyclOps)輔助下的全集成自主平臺，簡化了多種靶點-到-先導化合物的優化方案(圖19)，其想法是提供一個能夠集成自動化和連續流機器的閉環SAR系統。CyclOps是由具有液體處理元件的商用模塊化反應器組成的，用于將起始材料和試劑輸送到注入回路中。一旦反應混合物從反應器中洗脫后，粗混合物被制備型高效液相色譜(HPLC)提純并進行分析，然后收集到一個餾分收集器中。一旦確定了最終的濃度和純度，液體處理機器人就會取下一部分樣品，用緩沖液稀釋，然后在基于芯片的熒光分析中進行測試。IC50數值得到的結果非常容易通過設計算法處理，以建議下一個化合物在虛擬空間經過評估后被合成。

圖19 Cyclofluidic公司的閉環CyclOps平臺，基于輔助算法的藥物設計用于Abl激酶抑制劑的全集成、全自動的合成、純化和篩選。

該平臺首次被驗證可用于發現新的Abl激酶抑制劑(圖19)。對帕納替尼(31)的X射線衍射(XRD)結構得知，一個已知的抑制劑結合到Abl激酶的活性部位，兩個經過識別結構熱點用于配體的設計，在四(三苯基膦)鈀(0)為催化劑、銅圈作為流動反應器的情況下，為芳基鹵化物(10個片段，120 mM的DMF溶液)和炔(27個片段，120 mM的DMF溶液)的Sonogashira交叉偶聯反應做準備。在第一輪合成SAR的過程中，僅在30小時內就在潛在的目標化學空間(270個化合物)內生成并篩選了22個化合物，并得到了熱圖矩陣，其中兩種算法將輔助下一個化合物的分子設計。在第一個實驗集的數據基礎上，進行第二輪SAR循環。經過90個設計合成篩選周期，在大約4天內合成了64個新化合物，并對Abl1和Abl2激酶進行評價，總體合成成功率為71%，分離收率為5%至30%不等。從研究中，11種化合物被發現是Abl1/Abl2的有效抑制劑，IC50值在低納摩爾范圍內，與傳統的生物測定方法相比，顯示出高水平的相關性(圖19)。有趣的是，所選擇的靶點化合物也是所有臨床相關Abl1突變體的有效抑制劑，并且對Abl1的選擇性超過P38α的副產物，酰胺衍生物32也被賦予了良好的膜通透性和對人肝微粒體的適當清除。

CyclOps同樣可通過兩步法自動流合成應用到黃嘌呤基二肽基肽酶4 (DPP4)抑制劑的開發(圖20)。特別地，反應是通過在N-甲基-2-吡咯烷酮 (NMP)中自動注入8-溴代黃嘌呤(0.3 M)，并在同一溶劑中注入所需的保護二胺溶液(0.6 M)進行的?；旌虾?，反應依次在2 mL不銹鋼盤管中進行，加熱溫度為150℃，總流量為0.1 mL min-1(τ = 20 min)。隨后，將反應器的產物與泵送50 μL min-1的甲烷磺酸水溶液(30 wt %)混合，并將混合物通過第二個2 mL盤管反應器泵送，在90℃加熱(τ = 13 min)去除BOC。反應產物經在線液相色譜質譜系統純化，緩沖液稀釋，多孔板測定豬和人DDP4殘留酶活性。采用這種迭代循環，12個化合物在24小時內被合成，收率從3%到38%不等。有趣的是，12個分子中的5個(化合物33-37)對兩種酶都表現出納奈摩爾級的抑制活性。利用從SAR分析中獲得的數據，利用一系列氨基醇代替BOC-保護的二胺進一步擴展化學探測?？傮w來說，29種化合物在高純度的制備和測試僅在三天內完成，化學成功率為93%。同樣觀察到與以前通過傳統方法獲得的數據高度相關(圖20)。

?圖20 Cyclofluidic公司的閉環CyclOps平臺，基于輔助算法的藥物設計，全面集成、全自動合成、純化、篩選二肽基肽酶4 (DPP4)抑制劑。

最近，Cyclofluidic公司展示了CyclOps平臺在蛋白酶抑制劑領域的成功應用(圖21)。在本案例研究中，從商業上可獲得的化合物中產生的初步合成的SAR數據輸入被用來鑒定一系列具有顯著效力、選擇性和結構操作的化學適應性的靶標。特別地，從化合物38 (IC50?= 1.13 μM)開始，該化合物對尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)具有良好的選擇性(IC50 > 10 μM)，采用液相色譜/質譜/蒸發光散射(ELSD)聯用流合成器進行分析和純化，結合生物法測定蛋白酶和uPA測試，以及在線色譜測定。該系統使用一種基質選擇和效力預測算法完成(圖21)。特別是，硅基化氨基酸三甲基硅基酯的貯存溶液(0.35M的CH2Cl2)，在二異丙基乙胺(DIPEA)存在下，總流速為100 mol L min?1，并在60℃下反應到2 mL反應器線圈中，和所需的磺酰氯化物，酰氯化物，異氰酸酯(0.42 M的CH2Cl2)進行混合。20分鐘后，鹽酸脒、豆莢溶液(0.35M的NMP)以及六氟磷酸阿扎苯并三唑四甲基烏溴銨溶液(HATU)(0.35 M的NMP)整合成中間體，進而作為偶聯劑以50 μL min?1的流量通過每一個泵進行泵送。在100℃加熱時，混合物被反應到第二個2 mL反應器線圈(τ = 10 min)。選擇了63種氨基酸、磺酰/氯酸/異氰酸酯和氨基酰胺的反應物，覆蓋了5472種化合物的虛擬化學空間。最佳目標采樣(BOUS)是一種多參數優化方法，用于設計新的改進的類似物。初步進行了24個閉環合成篩選實驗，共63個產品，活性化合物含量為70%。第一次SAR運行允許將所調查的虛擬化學空間從5472減少到297個化學實體。采用Chase Objective tool進行多次閉環實驗，鑒定出39，含有(R)-環己基甘氨酸殘基的衍生物，其納摩爾IC50值(33 nM)是最有效且選擇性指數(蛋白酶/uPA)大于100的化合物。兩套新的22合成篩選循環和21個封閉循環實驗被執行使用氨基酸池的一個受限子集。(R)-苯基甘氨酸衍生物40是最好的化合物，具有納米級蛋白酶抑制(IC50?= 22 nM)和高uPA選擇性(> 6000倍)。根據10種絲氨酸蛋白酶的選擇性譜、ADMET譜(溶解度、PAMPA通透性、小鼠和人微粒體的代謝穩定性、Hep-G2細胞的細胞毒性)，對先導物40進行了表征，并在致癌功能測定中進行了測試?？偟膩碚f，使用CyclOps平臺在9天內(每周期90分鐘)提供了142個化合物(超過5000種可能的組合)，其活性和選擇性優于uPA。

圖21 Cyclofluidic公司的閉環CyclOps平臺，用于蛋白酶抑制劑的全集成、全自動的合成、純化和篩選，輔助基于算法的藥物設計。

2014年，Hoffman-LaRoche大學的研究人員公開了一種類似的自主組裝裝置，用于快速生成β-分泌酶(BACE1)抑制劑。一個小的酰胺庫可在4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基四氟硼酸銨(DMT-MM, 0.083 M, DMSO或DMSO/ DMF, 1:1)存在時，從兩個商用苯胺類(0.06 M的DMSO或DMSO/DMF, 1:1)和10個羧酸合成纖維(0.0083 M的DMSO或DMSO/DMF, 1:1)得到，在流動條件下合成，用高效液相色譜法純化(圖22)。等分(4-5 mL)的純化化合物是由液體處理器收集，分析了質量純度估計(81-98%)，用HPLC-ELSD校準方法進行量化評估最終的濃度，在劑量反應芯片分析和測試提供在60分鐘每個化合物的總周期時間的IC50值。有趣的是，為了提高采樣精度，同時最小化測試所需的化合物量，使用玻璃毛細管控制擴散產生了濃度梯度。值得注意的是，該系統產生的SAR數據可與傳統方法獲得的數據進行比較?；衔?1最終被鑒定為庫中最強的BACE1 (IC50 = 12 nM)。?

圖22 完全集成和自動化流系統的生成BACE1抑制劑。

2016年，首個用于合成生物學的可編程多用途微流體組件被開發出來。該系統由微流控芯片、電子氣動控制系統、溫度調節器和具有基于web界面的自動化軟件組成(圖23)。該實驗室-芯片平臺能夠利用分層DNA構建(IHDC)技術，將DNA庫的設計、合成、轉化為不同宿主(如大腸桿菌和釀酒酵母)等迭代合成生物學步驟集成自動化。這種方法是專門為微流體功能分析而設計的，包括細胞生長、蛋白表達誘導、比色分析以及圖像數據分析。

圖23 合成生物學的第一個自動微流控平臺示意圖。

與上述工作類似，MacConnell及其同事描述了一種基于微流體的超高通量沖擊序列反褶積裝置(圖24)。這個微型裝置通過將庫先導物分布到pL-級檢測試劑滴中能夠檢測DNA-編碼的先導化合物，可從先導物中進行化合物的光化學裂解，檢測孵化，激光誘導熒光結合檢測用于靶點鑒定，和采用熒光激活液滴分選和DNA條形碼測序分離。因此，將具有陽性對照抑制劑抑肽素A的DNA-編碼先導物(直徑10 μm，1920個先導物，729個編碼序列)與陰性對照先導物(58000個先導物，1728個編碼序列)混合，通過生化酶活性測定篩選組織蛋白酶D抑制作用?？偟膩碚f，測定(18分鐘孵育，240分鐘分析)時間在4小時內，混合測定體積和0.05 mg的先導物的篩查只需要120次。值得注意的是，采用模板條形碼策略，可以將錯誤發現率從目測的24%降低到2.6%。?

圖24 基于DNA-編碼先導化合物序列的超高通量靶點反褶積微流控平臺。

最近，Guo及其同事報道了一個基于流合成和識別蛋白結合物的集成平臺(圖25)。特別是，通過使用一個快速的微尺度流合成加上凝膠排阻色譜(SEC)-MS技術，模塊化平臺解決了傳統蛋白質-定向的動態組合化學的主要局限性(DCC)，包括在低濃度下抑制劑的不良反應性，在長時間的平衡時間內，蛋白質活性的降低或抑制劑的分解，以及目前可用的分析檢測方法的低吞吐量。本系統基于從醇和羧酸池中發現藥物片段的原理，通過制備和測試動態組合庫(DCLs)，應用在了牛血清白蛋白競爭性抑制劑的鑒定。首先，在微流控和常規間歇條件下合成了四個成員的DCL。該裝置包括所需的羧酸(10 mM)和醇(15 mM)在己烷中酯化。將得到的DLCs成員以61 μL min?1的流速泵送，并與以61 μL min?1的流速泵送含有H2SO4 (pH = 1, 1.5 mM)和BSA (10 mM)的蒸餾水中進行結合。在50℃使用GC檢測器來監測達到平衡時，培養是在微反應器中進行(V = 7.32 mL, τ = 60 min)。值得注意的是，較高的表面積-體積比和增強的質量/傳熱微流體的分批模式導致減少了12倍的平衡時間。此外，研究者準備一個由528個成員組成的更大的DCL來評估這種方法的通用性。有趣的是，當HRMS分析批量制備的DCL時，發現棕櫚酸乙酯42是作為BSA的唯一粘合劑，而微流控平臺發現了十八酸乙酯43。通過熒光測定，確認了十八酸乙酯43的結合。結果觀察到，十八酸乙酯43和棕櫚酸乙酯42的結合常數KD分別為4.95和5.21×104 L mol-1時，BSA的固有熒光在濃度依賴性的猝滅(280 nm激發和348 nm熒光發射)。最后，用Stern Volmer動態猝滅法對不同溫度下十八酸乙酯43與牛血清白蛋白的結合進行定量分析，結果證實只有一個結合位點參與了復雜的十八酸乙酯牛血清白蛋白的形成。

圖25 用于蛋白質結合物的合成和鑒定的集成流平臺。

展望與結論

科學和技術的進步，如合成機器、活性預測模型和自動化篩選設備，可以極大地革新藥物發現，特別是在早期階段，為學術界和制藥公司驗證創新方法及其轉化潛力提供了肥沃的土壤。從手工化學到自動化合成器以及它們與分子設計的結合，PAT和在線測試引領了藥物發現的一個全新時代，從而加速從靶點到上市藥物的旅程。然而，重要的是不要重復過去高估技術潛力的錯誤，而是要批判性地分析當前最先進技術的優缺點。雖然化學庫的自動生成以及通過適應學習周期對有前途的先導物進行系統優化在很大程度上可以被認為是既成事實，但實現用于化合物設計、合成、分析和數據分析的完整集成平臺仍然具有挑戰性，與實驗室常規工作距離很遠。

在這種不斷演變的情況下，學術界必須重組教育和研究，以縮小基礎科學、轉化研究和藥物開發之間的巨大差距，同時提高學術界和產業界之間的合作質量，最終必然推動創新。堅信，只有通過學術界和制藥公司、金融機構和政府機構之間強強合作，才能應對未來的挑戰，并對化學科學、藥物發現研究、最終對人類健康產生深遠影響。

參考文獻：

Antimo Gioiello, Alessandro Piccinno, Anna Maria Lozza, and Bruno Cerra. The Medicinal Chemistry in the Era of Machines and Automation: Recent Advances in Continuous Flow Technology.?J. Med. Chem. 2020 63(13), 6624-6647. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.9b01956