先睹為快
靶點?
羧酸酯酶carboxylesterase（LαE7）PDB ID：4FNG
篩選化合物庫
23,000硼酸類市售化合物的分子庫
計算方法
共價虛擬篩選（Covalent Virtual Screen）
計算軟件
DOCK3.6（http://covalent.docking.org/）
單位與作者信息
澳大利亞國立大學的Colin J. Jackson教授，
魏茨曼科學研究所的Nir London教授
發表雜志
The Proceedings of the National Academy of Sciences
計算流程
? ?本文作者用共價抑制劑篩選的DOCKovalent算法，針對LcαE7的蛋白晶體結構篩選了23000硼酸分子庫。手動檢查對接結果中排名前500（top2%）的結合模式，最終，綜合直覺、價格和商業用途等因素挑選出5個候選化合物, 實驗測試均為nM級別。
背景介紹
隨著世界人口的增加，農業生產力對維持糧食安全至關重要。殺蟲劑可以控制農業害蟲和病媒，進而保障了全球糧食安全和健康。就全球健康而言，殺蟲劑是抵御許多傳染病的第一道防線；在發展中國家，殺蟲劑尤其重要，因為在發展中國家，昆蟲傳播媒介占所有傳染病的近20%，然而，殺蟲劑的廣泛使用已經選擇出了具有抗藥性的昆蟲。自20世紀40年代以來，報告抗藥性的昆蟲種類迅速增加，已超過580種?？顾幮允箽⑾x劑失效，導致了殺蟲劑使用量的增加，對環境造成了嚴重的影響?？顾幮詮V泛存在，已然成為緊迫的全球性問題。有機磷酸酯Organophosphates和氨基甲酸酯carbamates是目前使用最廣泛的兩類殺蟲劑。它們通過對親核活性位點的絲氨酸殘基磷酸化/氨甲?；?，來抑制膽堿能神經肌肉連接處的乙酰膽堿酯酶(AChE)，導致乙酰膽堿在生物體內不斷積累，最終導致其無休止的神經信號傳導和死亡。對有機磷農藥（OPs）等殺蟲劑的抗性通常涉及羧酸酯酶carboxylesterases (CEs)對OPs的分離或水解?？朔顾幮灾饕陂_發具有新的作用方式的新型殺蟲劑，盡管這些新靶點中有許多顯示出希望，但生物化學靶點的數量有限，而且新靶點對靶點不敏感和代謝抵抗的問題也不可避免。既然，殺蟲劑的抗性通常涉及羧酸酯酶，抑制羧酸酯酶是可以恢復已形成抗性的OPs的有效性。這種通過抑制殺蟲劑抗性所涉及的酶來提高殺蟲劑的效力（增效劑）的最突出的一個案例就是胡椒基丁醇，可用于增強氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯的活性。
增效劑的概念可以進一步具體地針對已經進化成具有代謝抗性的酶，從而將殺蟲劑的功效恢復到抗藥性前的水平。因此，可以針對殺蟲劑抗性的理想靶標羧酸酯酶，如LcαE7，設計消除抗藥性的抑制劑（圖1）。LcαE7通過典型絲氨酸水解酶機制催化脂肪酸底物的水解。已知硼酸與絲氨酸水解酶的絲氨酸形成可逆共價加合物，其模擬了羧酸酯水解的過渡態幾何結構，因此具有高親和力。?
圖1.?有機磷殺蟲劑OPs增敏劑概述
圖片來源PNAS
計算方法和結果部分
本文作者使用DOCK3.6軟件里面的共價抑制劑虛擬篩選的通用方法DOCKovalent算法（http://covalent.docking.org/），針對LcαE7的蛋白晶體結構（PDB 編號：4FNG）篩選了23,000硼酸類市售化合物的分子庫，手動檢查對接結果中排名前500（top2%）的結合模式，最終，綜合直覺、價格和商業用途等因素挑選出5個候選化合物。
蛋白的前處理時將關鍵殘基Ser218設置為去質子化狀態，His471設為雙質子化狀態；在配體準備過程中，由于無法參數化B原子，用C原子取代，這種替換并不會影響打分結果。共價對接中將形成的B-Oγ鍵長設為1.5 ± 0.1 ?，鍵角Cβ-Oγ-B = 116.0 ± 5° 和 Oγ-B-R（Ligatom）=109.5±5°。并且在測試化合物的手動選擇中，優先選擇硼酸的羥基占據氧陰離子孔（由Gly136、Gly137和Ala219的主鏈氮形成）（圖2）。
圖2. 虛擬篩選過程中硼酸分子與LcαE7酶Ser218殘基配位模式
圖片來源PNAS
篩選的5種化合物都有一個苯基硼酸（PBA）亞結構。作者解決了LcαE7酶與化合物1-5的共晶結構(圖3-紫色棍棒結構)，很大程度上驗證DOCKovalent預測的對接模式（圖3-黃色棍棒結構）。篩選的5個硼酸化合物對野生型 LcαE7酶的Ki值均低于12 nm，其中最強的化合物3的Ki值為250 pm。對于突變型Gly137Asp LcαE7酶而言，化合物2的抑制活性表現最好（Ki=29nM）。
圖3. 共價對接預測的lcαe7的有效抑制劑的化學結構和復合物共晶結構
圖片來源PNAS
為了在保持良好的野生型效價同時提高對突變體gly137asp的抑制作用，作者基于構效關系的研究，進一步優化了抑制劑的結構，得到了目標化合物3.9和3.10，并結晶了3.10抑制劑和突變體Gly137Asp LcαE7酶的共晶體（圖4)。
圖4. 化合物3和3.10的化學結構式和復合物的結合模式圖
圖片來源PNAS
與抑制劑3相比，發現3.10的取向更加保守，3-溴取代基與活性中心高度互補，5-苯氧基取代基朝向活性中心的狹窄空間，避免了與Asp137側鏈的立體位阻。最令人驚訝的是，化合物3.10采用的是四面體幾何結構，而不是化合物3觀察到的三角平面幾何結構。四面體硼酸化合物與絲氨酸水解酶的親和力結合更高，這也進一步解釋了3.10化合物在活性上高于3化合物6.1倍。
進一步的藥理實驗證明，這類化合物可以選擇性作用于LcαE7，在高劑量下對哺乳動物無害；通過對蠅蛆菌株的測試結果顯示，LcαE7酶抑制劑可以作為增效劑來恢復OPs殺蟲劑的藥效；并且在毒死桃-馬鈴薯蚜蟲中也起到了協同作用，這表明硼酸類LcαE7酶抑制劑具有廣譜殺蟲劑增效劑的潛力（圖5）。
圖5. 硼酸化合物的酶選擇性驗證和OPs殺蟲劑協同作用實驗
圖片來源PNAS
總結
本文報道1了一種利用計算設計高效特異性的LcαE7酶抑制劑。利用DOCKo -valent算法，基于靶點LcαE7酶結合口袋的Ser218的共價作用模式，對23000硼酸數據庫搜索，得到了一系列的共價小分子化合物，再結合構效關系的研究，發現了活性更佳的先導化合物。這些化合物逆轉了兩種不同害蟲的抗藥性，可以在不影響藥效的情況下大幅度減少殺蟲劑的使用，可產生重大的經濟和環境效益。
DOCKovalent算法是由Nir London教授2等人開發的一種高通量共價虛擬篩選的在線服務型數據庫（http://covalent.docking.org）。DOCKovalent數據庫包含了不同類型的親電化合物，包含了醛類，硼酸類，氰基丙烯酰胺類等；并且大多配體的立體結構及構型都是事先準備好的，所以很適合研究者對感興趣的靶點進行快速的共價對接，打分函數主要評價配體和受體的范德華力和親電相互作用，并根據打分結果進行排序。
參考文獻：
1. Correy, G. J.; Zaidman, D.; Harmelin, A.; Carvalho, S.; Mabbitt, P. D.; Calaora, V.; James, P. J.; Kotze, A. C.; Jackson, C. J.; London, N., Overcoming insecticide resistance through computational inhibitor design. Proceedings of the National Academy of Sciences 2019, 201909130.
2. London, N.; Miller, R. M.; Krishnan, S.; Uchida, K.; Irwin, J. J.; Eidam, O.; Gibold, L.; Cimerman?i?, P.; Bonnet, R.; Shoichet, B. K., Covalent docking of large libraries for the discovery of chemical probes. Nature chemical biology 2014, 10 (12), 1066.