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    PNAS | 共價對接發現nM級抗藥性殺蟲劑

    先睹為快

    靶點?

    羧酸酯酶carboxylesterase(LαE7)PDB ID:4FNG

    篩選化合物庫

    23,000硼酸類市售化合物的分子庫

    計算方法

    共價虛擬篩選(Covalent Virtual Screen)

    計算軟件

    DOCK3.6(http://covalent.docking.org/)

    單位與作者信息

    澳大利亞國立大學的Colin J. Jackson教授,

    魏茨曼科學研究所的Nir London教授

    發表雜志

    The Proceedings of the National Academy of Sciences

    計算流程

    ? ?本文作者用共價抑制劑篩選的DOCKovalent算法,針對LcαE7的蛋白晶體結構篩選了23000硼酸分子庫。手動檢查對接結果中排名前500(top2%)的結合模式,最終,綜合直覺、價格和商業用途等因素挑選出5個候選化合物, 實驗測試均為nM級別。

    背景介紹

    隨著世界人口的增加,農業生產力對維持糧食安全至關重要。殺蟲劑可以控制農業害蟲和病媒,進而保障了全球糧食安全和健康。就全球健康而言,殺蟲劑是抵御許多傳染病的第一道防線;在發展中國家,殺蟲劑尤其重要,因為在發展中國家,昆蟲傳播媒介占所有傳染病的近20%,然而,殺蟲劑的廣泛使用已經選擇出了具有抗藥性的昆蟲。自20世紀40年代以來,報告抗藥性的昆蟲種類迅速增加,已超過580種??顾幮允箽⑾x劑失效,導致了殺蟲劑使用量的增加,對環境造成了嚴重的影響??顾幮詮V泛存在,已然成為緊迫的全球性問題。有機磷酸酯Organophosphates和氨基甲酸酯carbamates是目前使用最廣泛的兩類殺蟲劑。它們通過對親核活性位點的絲氨酸殘基磷酸化/氨甲?;?,來抑制膽堿能神經肌肉連接處的乙酰膽堿酯酶(AChE),導致乙酰膽堿在生物體內不斷積累,最終導致其無休止的神經信號傳導和死亡。對有機磷農藥(OPs)等殺蟲劑的抗性通常涉及羧酸酯酶carboxylesterases (CEs)對OPs的分離或水解??朔顾幮灾饕陂_發具有新的作用方式的新型殺蟲劑,盡管這些新靶點中有許多顯示出希望,但生物化學靶點的數量有限,而且新靶點對靶點不敏感和代謝抵抗的問題也不可避免。既然,殺蟲劑的抗性通常涉及羧酸酯酶,抑制羧酸酯酶是可以恢復已形成抗性的OPs的有效性。這種通過抑制殺蟲劑抗性所涉及的酶來提高殺蟲劑的效力(增效劑)的最突出的一個案例就是胡椒基丁醇,可用于增強氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯的活性。

    增效劑的概念可以進一步具體地針對已經進化成具有代謝抗性的酶,從而將殺蟲劑的功效恢復到抗藥性前的水平。因此,可以針對殺蟲劑抗性的理想靶標羧酸酯酶,如LcαE7,設計消除抗藥性的抑制劑(圖1)。LcαE7通過典型絲氨酸水解酶機制催化脂肪酸底物的水解。已知硼酸與絲氨酸水解酶的絲氨酸形成可逆共價加合物,其模擬了羧酸酯水解的過渡態幾何結構,因此具有高親和力。?

    圖1.?有機磷殺蟲劑OPs增敏劑概述

    圖片來源PNAS

    計算方法和結果部分

    本文作者使用DOCK3.6軟件里面的共價抑制劑虛擬篩選的通用方法DOCKovalent算法(http://covalent.docking.org/),針對LcαE7的蛋白晶體結構(PDB 編號:4FNG)篩選了23,000硼酸類市售化合物的分子庫,手動檢查對接結果中排名前500(top2%)的結合模式,最終,綜合直覺、價格和商業用途等因素挑選出5個候選化合物。

    蛋白的前處理時將關鍵殘基Ser218設置為去質子化狀態,His471設為雙質子化狀態;在配體準備過程中,由于無法參數化B原子,用C原子取代,這種替換并不會影響打分結果。共價對接中將形成的B-Oγ鍵長設為1.5 ± 0.1 ?,鍵角Cβ-Oγ-B = 116.0 ± 5° 和 Oγ-B-R(Ligatom)=109.5±5°。并且在測試化合物的手動選擇中,優先選擇硼酸的羥基占據氧陰離子孔(由Gly136、Gly137和Ala219的主鏈氮形成)(圖2)。

    圖2. 虛擬篩選過程中硼酸分子與LcαE7酶Ser218殘基配位模式

    圖片來源PNAS

    篩選的5種化合物都有一個苯基硼酸(PBA)亞結構。作者解決了LcαE7酶與化合物1-5的共晶結構(圖3-紫色棍棒結構),很大程度上驗證DOCKovalent預測的對接模式(圖3-黃色棍棒結構)。篩選的5個硼酸化合物對野生型 LcαE7酶的Ki值均低于12 nm,其中最強的化合物3的Ki值為250 pm。對于突變型Gly137Asp LcαE7酶而言,化合物2的抑制活性表現最好(Ki=29nM)。

    圖3. 共價對接預測的lcαe7的有效抑制劑的化學結構和復合物共晶結構

    圖片來源PNAS

    為了在保持良好的野生型效價同時提高對突變體gly137asp的抑制作用,作者基于構效關系的研究,進一步優化了抑制劑的結構,得到了目標化合物3.9和3.10,并結晶了3.10抑制劑和突變體Gly137Asp LcαE7酶的共晶體(圖4)。

    圖4. 化合物3和3.10的化學結構式和復合物的結合模式圖

    圖片來源PNAS

    與抑制劑3相比,發現3.10的取向更加保守,3-溴取代基與活性中心高度互補,5-苯氧基取代基朝向活性中心的狹窄空間,避免了與Asp137側鏈的立體位阻。最令人驚訝的是,化合物3.10采用的是四面體幾何結構,而不是化合物3觀察到的三角平面幾何結構。四面體硼酸化合物與絲氨酸水解酶的親和力結合更高,這也進一步解釋了3.10化合物在活性上高于3化合物6.1倍。

    進一步的藥理實驗證明,這類化合物可以選擇性作用于LcαE7,在高劑量下對哺乳動物無害;通過對蠅蛆菌株的測試結果顯示,LcαE7酶抑制劑可以作為增效劑來恢復OPs殺蟲劑的藥效;并且在毒死桃-馬鈴薯蚜蟲中也起到了協同作用,這表明硼酸類LcαE7酶抑制劑具有廣譜殺蟲劑增效劑的潛力(圖5)。

    圖5. 硼酸化合物的酶選擇性驗證和OPs殺蟲劑協同作用實驗

    圖片來源PNAS

    總結

    本文報道1了一種利用計算設計高效特異性的LcαE7酶抑制劑。利用DOCKo -valent算法,基于靶點LcαE7酶結合口袋的Ser218的共價作用模式,對23000硼酸數據庫搜索,得到了一系列的共價小分子化合物,再結合構效關系的研究,發現了活性更佳的先導化合物。這些化合物逆轉了兩種不同害蟲的抗藥性,可以在不影響藥效的情況下大幅度減少殺蟲劑的使用,可產生重大的經濟和環境效益。

    DOCKovalent算法是由Nir London教授2等人開發的一種高通量共價虛擬篩選的在線服務型數據庫(http://covalent.docking.org)。DOCKovalent數據庫包含了不同類型的親電化合物,包含了醛類,硼酸類,氰基丙烯酰胺類等;并且大多配體的立體結構及構型都是事先準備好的,所以很適合研究者對感興趣的靶點進行快速的共價對接,打分函數主要評價配體和受體的范德華力和親電相互作用,并根據打分結果進行排序。

    參考文獻:

    1. Correy, G. J.; Zaidman, D.; Harmelin, A.; Carvalho, S.; Mabbitt, P. D.; Calaora, V.; James, P. J.; Kotze, A. C.; Jackson, C. J.; London, N., Overcoming insecticide resistance through computational inhibitor design. Proceedings of the National Academy of Sciences 2019, 201909130.

    2. London, N.; Miller, R. M.; Krishnan, S.; Uchida, K.; Irwin, J. J.; Eidam, O.; Gibold, L.; Cimerman?i?, P.; Bonnet, R.; Shoichet, B. K., Covalent docking of large libraries for the discovery of chemical probes. Nature chemical biology 2014, 10 (12), 1066.

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