蛋白質設計是一門時興的交叉學科，蛋白質設計可以對已知結構的蛋白質分子性質與功能的改良，甚至發現新的功能；也包括從頭設計全新蛋白，以期得到期望的蛋白三維結構與功能。眾所周知，許多生物學功能的發揮依賴于蛋白所處的環境，甚至環境條件的變化可能驅動蛋白在不同狀態之間切換，如pH-響應的蛋白構象變化。目前，對于pH-調控蛋白構象變化的分子設計受限于蛋白構象的pH響應很難被準確預測和調整，這對于蛋白質從頭設計則是更大的挑戰。
最近，David Baker課題組利用蛋白亞基界面間的組氨酸氫鍵網絡，從頭設計出了可調節的pH-響應低聚蛋白(pROs)。由于組氨酸殘基在低pH值下質子化會破壞氫鍵網絡，可導致亞基界面間出現空間和靜電排斥。所設計的α-螺旋束的重復幾何截面，允許以模塊的方式添加或刪除氫鍵網絡，從而可以通過改變組氨酸氫鍵網絡數量，調整蛋白響應的pH范圍以及協同性。這是一個理論預測結合實驗驗證的工作，其蛋白分子設計的成功得益于Bakerl團隊開發的Rosetta軟件，該軟件可以說是當前蛋白質結構預測中最著名的軟件了。
如圖1所示，首先，他們采用把組氨酸氫鍵網絡埋入亞基界面間，并結合周圍疏水作用包裝起來的思想，利用Rosetta蛋白設計軟件首先設計出了三個同三聚體（pRO-1,2,3）和兩個異二聚體蛋白(pRO-4,5)，隨后在實驗中進行了表達和測試。在pH為中性時，除pRO-1外，所有設計蛋白均組裝為預期的低聚態。后續他們的實驗分析測定基于pRO2-5進行，并選擇了效果最好的pRO-2做進一步的分析改進。通過對比pRO-2和將其氫鍵網絡替換為不含組氨酸的pRO-2-noHis發現，當pH降至酸性時，pRO-2會發生協同的、pH依賴的蛋白四級結構分解(低聚體蛋白解離為單體)，而pRO-2-noHis中則無此現象。在pRO-3,4,5中也均具有pH依賴的低聚體解離現象。此外pRO-4中L23A/V130A突變可進一步增強pH敏感性。
?
圖1?pROs的設計
圖片來源：Science
模型根據亞基進行著色（綠色，青色和粉紅色），紅色框內表示包含組氨酸氫鍵網絡的截面。(A)設計策略:組氨酸殘基在低pH條件下質子化時會破壞分子間界面穩定性。(B)將所設計pRO-2中含組氨酸的氫鍵網絡替換為pRO-2-noHis中不含組氨酸的氫鍵網絡。(C)質譜結果顯示 pRO-2中（上）當pH降至5.5以下時，會發生協同的、pH依賴的蛋白四級結構分解。pRO-2-noHis中（下）則無此現象。(D)CD MRE圖顯示pRO-2穩定性顯著依賴于pH。(E)所設計含組氨酸的同三聚體模型pRO-3和異二聚體pRO-4、pRO-5。(F)對應模型的質譜結果。其中pRO-4的L23A/V130A突變可以削弱截面作用增強pH敏感性。
圖2高分辨率x射線晶體結構與設計模型非常接近
圖片來源：Science
左圖，設計模型示意圖；中圖，所選結構與晶體結構的比較；右圖，蛋白主鏈結構與晶體結構疊合。其中設計模型按照亞基著色，晶體結構顯示為白色。
在此基礎上，利用設計蛋白氫鍵網絡模塊化的特征，結合pRO-2和pRO-2-noHis的氫鍵網絡，設計了在pH回升至7時可重新組裝為低聚體并更利于結晶的pRO-2.3和pRO-2.5。獲得pRO-2.3和pRO-2.5的晶體結果并將設計模型與晶體結構疊合，發現設計模型的整體結構及氫鍵網絡均與晶體結構中十分一致（圖2）。進一步結合組氨酸氫鍵網絡層，非組氨酸氫鍵網絡層及疏水性層三個相互作用層，嘗試調節不同層類的數目并進行組合后發現，蛋白響應pH變化所發生的四級結構分解（低聚體解離）的轉變點pH可以隨相互作用層的不同組合發生變化。具體來說，當組氨酸氫鍵網絡層與疏水性層的比值越高時，轉變點pH值也隨之升高。這使得設計蛋白的pH-依賴性構象變化可以根據不同相互作用層的組合進行精確的調控（圖3）。也就是說，Baker他們所設計的這些蛋白可以利用pH來調控其自組裝行為。
?
圖3轉變點pH及協同性的系統性調節
圖片來源：Science
(A) 疏水性層(n，黑色)、組氨酸網狀層(m，紅色)、缺乏組氨酸極性網狀層(l，藍色)的不同組合模型示意圖，數字為對應層的數目。(B) 對應模型的CD MRE圖。(C)?理論模型:三聚體豐度與pH的關系。(D) pH誘導的四級結構分解質譜監測圖。(E) m/n的比值越高時，轉變點pH (pH0)也隨之升高。
此外，實驗還發現所設計蛋白具有脂質體滲透活性。由于所設計三聚體蛋白界面中包含若干疏水殘基，這些殘基可在pH誘導的亞基解離后暴露，生成的水脂兩親性螺旋結構能夠破壞細胞膜。這使得設計蛋白無論在體外還是細胞內被內吞后，都能響應pH值發生構象變化破壞脂質膜，使他們成為可能的生物制劑傳遞系統設計方案（圖4）（圖5）。因此，文章設計的蛋白不僅實現了可調節的由pH驅動的構象開關變化，以及利用模塊化相互作用調節蛋白設計模型性質的方法，還為生物制劑胞內遞送提供了潛在的新思路。
?
圖4 pH-依賴的膜滲透作用
將蛋白添加到包裹了猝滅SRB熒光染料的合成脂質體中，通過從破裂的膜中滲出的染料來測量活性。
?
圖5 pH-誘導膜滲透的影像
將蛋白添加到包裹了猝滅SRB熒光染料的合成脂質體中，通過從破裂的膜中滲出的染料來測量活性。
?
參考文獻
Boyken, S. E.; Baker, D.* et al., Science 2019, 364, 658–664.?