JMC | PROTAC技術在藥物發現中的優勢與挑戰

傳統藥物發現策略的局限性

傳統藥物設計常常專注于優化藥物結合親和力，但往往限制了更多高效藥物的發現，因為識別一種高效能和高選擇性的藥物來調節一個生物靶點并不總是那么簡單，面對越來越多缺乏高親和力配體結合位點的藥物干預靶點的發現，傳統的小分子成藥技術顯得無計可施。

越來越多的方法被用來規避這些限制，單克隆抗體和其他蛋白制劑雖然具有高親和力和選擇性的優勢，但這些制劑目前只能應用于細胞外或細胞表面靶點，而大多數基因組蛋白質和當代藥物靶點是在細胞內發揮作用。通過基因沉默或RNA抑制劑作用于靶點，雖然在臨床前是非常有效的，但必需的寡核苷酸制劑本身也存在著多項挑戰（細胞傳遞、穩定性、生物分布、選擇性等），必須克服這些挑戰才能開發出成功的藥物。

圖1.?PROTAC誘導蛋白降解的作用機制

圖片來源：ACS Chemical Biology

靶向蛋白降解嵌合體 (PROTAC)技術簡介

靶向蛋白降解嵌合體?(PROTAC)不同于傳統的小分子抑制劑，PROTAC采用的是事件驅動（event-driven）的藥理學作用模式，而非傳統的小分子占據驅動模式（occupancy-driven）。PROTAC誘導蛋白降解的作用機制見圖1，PROTAC分子包括三部分，一頭是靶向目的蛋白結構，另一頭招募泛素E3連接酶，中間通過合適的連接體（linker）連接，通過連接體將靶蛋白配體與泛素E3連接酶配體連接一起，在體內分別識別靶蛋白和泛素E3連接酶，通過誘導招募泛素E3連接酶至靶蛋白表面，引發多聚泛素化過程誘導靶蛋白降解，從而達到疾病治療的效果。這種全新的小分子誘導藥理學的途徑對藥物發現過程產生了深遠影響。

借用自然：PROTAC技術的起源

自然界已經發展出一系列的生物途徑，通過精準的信號增強和衰減以及其他過程來維持生物內環境的穩定和細胞對刺激的反應。這些途徑只有一小部分步驟使用直接的小分子調節器（如激素和其他GPCR配體、突觸信號、代謝物傳感和調節），大多數調節是通過復雜的途徑進行的，最終導致蛋白質合成或轉換。隨著我們對細胞內源性蛋白質降解機制的理解越來越清楚，潛在的治療策略也開始出現。細胞內蛋白質的降解主要有兩種途徑，即泛素-蛋白酶體系統（UPS）和自噬/溶酶體途徑。其中，泛素-蛋白酶體系統是細胞內蛋白質降解的主要途徑，參與細胞內80%以上。以色列科學家Aaron Ciechanover、Avram Hershko和美國科學家Irwin Rose因共同發現了泛素調節的蛋白降解過程，獲得了2004年的諾貝爾化學獎。PROTAC技術便是來源于這項諾貝爾獎，其在一定程度上利用細胞內的泛素-蛋白酶體系統來降解掉目的蛋白，PROTAC將靶點蛋白連接到泛素E3連接酶，招募E2連接酶給目標蛋白加上泛素標簽，多聚泛素化之后的蛋白質被蛋白酶體識別并被蛋白質水解為氨基酸，PROTAC分子釋放出來，繼續進行重復的過程（圖2）。?

圖2. 靶點蛋白水解過程

圖片來源：Kymera Therapeutics

在設計PROTAC分子時，需要特別關注以下幾點，PROTAC分子必須與靶點蛋白和泛素化機制結合，形成有效的三元復合物，才能實現靶蛋白降解。因此，首先要保障PROTAC能透過細胞膜成功的進入細胞；一旦進入細胞內，蛋白質降解分子必須同時與目標蛋白和泛素化機制結合，形成三元復合物，避免形成二元復合物“hook effect”；三元復合物一旦形成，泛素必須以足夠的速率（快于三元復合物的本征壽命）轉移到靶蛋白受體位點上（通常是表面賴氨酸），所需底物的誘導泛素化也應以這樣的速率進行，以克服由二氫奎素酶競爭性去除泛素的情況；最后，泛素轉移到底物蛋白上的模式應允許蛋白酶體容易識別，從而開始實際降解。

蛋白質可與多種泛素形成不同長度的鏈和不同賴氨酸殘基（例如K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63和M1）連接的拓撲結構。在生理學上，不同的多泛素連接和鏈長/拓撲結構可以導致在蛋白質功能精細調節的復雜系統中的一系列細胞反應。其中，K48連接泛素和其他的線性鏈被認為有利于蛋白酶體識別。另外，蛋白酶體起始區域部分無序loop或domain的存在也很重要，在某些情況下，如果該區域不存在，蛋白質雖然可以廣泛多聚化，但不被蛋白酶體識別。

從概念到實踐：PROTAC技術的發展歷程

回顧PROTAC技術20年的發展歷史，有很多學者做出了重要貢獻，一些里程碑事件助力了PROTAC技術的發展，接下來將簡述下PROTAC技術的發展歷程（圖3）。人工誘導蛋白質降解的最早報道之一是在1995年設計了一系列與Ig結合基序融合的修飾E2結合酶（如TaUBC4），首次表明人工誘導的泛素化特征可被誘導降解的蛋白酶體識別。

圖3.?PROTAC領域發展史

2001年，?Deshaies和Crews實驗室利用了含SCFβ-TRCP的E3誘導了MetAp-2的降解，首次引入了靶向嵌合蛋白水解（PROTAC）一詞。這篇早期開創性論文選擇了一種卵白蛋白衍生物，它通過共價相互作用與Met-AP2結合。這種對共價鍵的依賴阻止了PROTAC的獨特優點之一，即其催化作用（見下文），潛在地限制了所觀察到的降解效率。在接下來的幾年里， PROTAC發展到能夠降解諸如雌激素受體（ER）和雄激素受體（AR）等靶點，由于早期的PROTAC分子多為小肽，細胞滲透性比較差，細胞活性也較低，無法應用到藥物的開發中。

直到2008年，Crews課題組首次報道了小分子PROTAC-nutlin，典型的小分子PROTAC結構如圖4所示，作用機制如圖5所示。Nutlin通過與E3連接酶Mdm2結合，誘導雄激素受體(AR)的降解，但其細胞活性仍不理想，在10μM濃度下才誘導AR降解，與此同時，盡管從所報道的有數據來看，降解是蛋白酶體依賴性的，但考慮到許多AR配體可以自發地破壞其同源受體的穩定性，引起自身泛素化和降解。因此，其在藥物發現的應用仍然有限。

圖4. 小分子PROTAC的三個基本單元

圖片來源：JMC

圖5. PROTAC分子的作用機制

圖片來源：JMC

2010-2012年，隨著Craig Crews團隊（耶魯大學的該領域的先驅）和Alessio Ciulli（劍橋大學，E3連接酶結構生物學專家）及其他合作者發現了更多泛素E3連接酶的結合體，PROTAC取得了重大的進展。2012年，VHL的高親和力擬肽配體被發現。隨后，Alessio Ciulli課題組報道了VHL擬肽配體的構效關系研究。

Craig Crews教授在2013年創立了Arvinas公司，公司專注于PROTAC技術，開發創新藥物，使得PROTAC技術得以迅速地發展。基于VHL的配體設計的PROTAC化合物具有更多類藥特性，可以大幅度提高細胞的穿透性，細胞活性可以達到納摩爾級別。另外，通過與VHL非結合性對映體設置對照試驗證明，PROTAC是通過利用含有VHL的E3泛素連接酶來降解蛋白激酶2（RIPK2）。繼前面的研究，Craig Crews團隊利用E3泛素連接酶cereblon設計了作用BET家族蛋白的小分子。

2015年是小分子PROTAC研究成果最豐碩的一年，宣布了PROTAC技術成為真正應用于藥物發現的方法，吸引了學術界和工業界，以及投資機構的關注，為新藥研發打開了新篇章。

PROTAC技術的優勢

與傳統的小分子拮抗劑相比，PROTAC具有一系列獨特的優勢：

催化降解功能。傳統的小分子采用的藥理學作用模式為占據驅動模式，為了提高靶點占有率，往往需要高劑量的藥物，反而會帶來很大的毒副作用。PROTAC采用的是事件驅動（event-driven）的藥理學作用模式，其對目的蛋白的降解過程是一種催化作用，因此只需較低的化合物濃度便可以達到很好的降解效率。

選擇性。現代藥物開發的一個關鍵目標是設計高選擇性分子，降低藥物毒性和副作用。PROTAC分子發揮催化作用時，可以選擇性的作用于特定的靶蛋白。最近的多項研究表明， PROTAC對同源靶蛋白的選擇性高于傳統抑制劑。

作用靶點廣。泛素-蛋白酶體系統是細胞內蛋白質降解的主要途徑，參與細胞內80%以上。E3泛素連接酶在多種細胞中廣泛表達，PROTAC分子只需將靶蛋白與E3泛素連接酶拉近，再通過蛋白溶酶體降解靶蛋白。因此PROTAC技術可以廣泛應用不同的靶點。

延長作用時間。靶蛋白的降解是時間依賴性的，PROTAC可以在幾分鐘內將細胞內靶蛋白消耗到接近基礎水平。一旦先前存在的蛋白耗盡，PROTAC只需要降解重新合成的靶蛋白，大多數蛋白質的再合成速度很慢，即使在PROTAC完全清除后，細胞可能仍需要一段相當長的時間，才能將蛋白質庫恢復生理信號的水平，從而大大延長作用時間。雖然口服給藥通常被認為是小分子藥物的首選給藥途徑，但患者的依從性，特別是對于更慢性的疾病，可能非常差，嚴重限制了治療效果。PROTAC可以通過多種途徑提供，提供更多有吸引力的臨床給藥方式。

新的藥理學作用模式。許多蛋白靶點對藥物研發提出了挑戰，它們可能沒有一個特定的催化活性位點，需要依賴于更大的蛋白質界面來介導信號，或者蛋白質可能具有多個功能和催化結構域。識別高親和力抑制劑對于這些靶點來說幾乎是一個不可能的事件，但是PROTAC技術可以提供一種解決方案，因為只需要粘合劑（與傳統抑制劑相反）來促進E3連接酶的募集和降解級聯的啟動。PROTAC的另一個優勢是其表型基因敲除的能力，利用PROTAC可以作為研究靶基因功能序列丟失的有力補充手段。

展望PROTAC技術的未來

PROTAC技術為新藥研發打開了新篇章，也給學術界和工業界帶了前所未有的機遇。當然，PROTAC作為一種新興的技術，必然也會面臨很多問題和挑戰，只有克服了這些困難，PROTAC技術才能更好的發展。

迄今為止， PROTAC技術已被應用于不同的靶點，從蛋白酶到核激素受體、表觀遺傳因子和激酶等。目前80%的蛋白缺少現有藥物的調控，主要是因為缺少可成藥的作用靶點，PROTAC技術應用于不可成藥靶點，是未來可以進一步研究和探索的內容。根據人類基因組，科學家預測有超過600個E3泛素連接酶。但迄今為止，只有一小部分被證明適合于PROTAC的開發,為了進一步發展PROTAC技術，未來需要努力確定其他可利用的E3泛素連接酶。設計更有效的PROTAC的另一個關鍵方面在于連接體Linker，連接體的長度和連接點都可能會影響選擇性和降解效率。同時為了簡化并加速PROTAC分子的發現，需要建立可靠的PROTAC技術平臺。隨著PROTAC分子進入臨床試驗研究，PROTAC技術未來的發展空間是毋容置疑的。

參考文獻

Churcher I . Protac-Induced Protein Degradation in Drug Discovery: Breaking the Rules or Just Making New Ones?[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2018, 61(2):444-452.