引言
理解酶催化作用不僅對基礎科學有重要意義，而且對實際應用也很重要。例如酶反應機理在藥物的合理設計中發揮著重要的作用，在藥物的合理設計中，可以通過模仿中間體或過渡態（TSs）的結構來開發抑制劑。?酶工程技術徹底改變了生物催化領域，因此，深入了解控制特異性和選擇性的反應機制和因素對指導具有所需特性的酶工程設計很有幫助。
在過去的幾十年中，研究人員陸續開發出了一系列能夠解決酶催化中各種問題的計算方法。常見的方法是分子對接，分子動力學模擬（MD），自由能擾動（FEP），經驗價鍵（EVB），量子力學結合分子力學（QM/MM）和簇方法。這些技術可以被認為是互補的，當然每種技術都有其自身的優點和缺點。?在不對稱生物催化領域，分子對接和分子動力學模擬已被廣泛使用，并且有助于定性合理化觀察到的選擇性，也可以合理或半合理地指導酶工程。在QM/MM方法中，對活性位點周圍的一小部分酶用量子力學方法處理，其余的酶以及周圍的水用分子力場進行處理。如今，這種方法在酶的立體選擇性中有許多應用。最新研究的例子有Walter Thiel在對映選擇性酶促Baeyer-Villiger反應方面的工作和南極假絲酵母脂肪酶B (CALB) 的O-乙?；磻?。在EVB方法中，首先在參考系統（例如在水溶液中）中研究反應，并調整參數以重現實驗可觀察值或更高級別的計算。然后將這些參數用于在酶環境中對反應進行建模，在該環境中可以計算出新的自由能圖。最近出現了一些將EVB用于酶對映選擇性的例子，例如脂肪酶的研究和環氧水解酶。在簇方法中，量化方法的選擇通常是使用密度泛函理論（DFT）。簇方法已用于研究酶促反應機理已有20多年的歷史了。?并被證明是富有成果的。然而，對映選擇性的研究對該方法提出了另外的挑戰。除了上述相對能量的精度要求外，模型還必須足夠大才能正確表示活性部位的手性環境。最初的簇模型很小，甚至少于100個原子，因此顯然無法建模酶對映選擇性。但隨著于計算機的發展，如今的模型通常約為300個原子或更多，因此可以對活動站點進行更可靠的建模。
簇模型的介紹
簇模型的方法，也稱為全QM方法，是一種用于研究酶活性位點的反應機理的簡單但強大的方法。通?；诿傅木w結構來設計活性位點的模型。選擇重要催化基團的殘基，定義為活性位點，其余的部分被截斷。隨著計算能力的發展，活性位點模型逐步擴大，如今300多個原子組成的模型非常普遍。盡管這是一個很大的進步，但是這個大小仍然代表了整個酶的很小一部分。具體選擇取決于研究的科學問題，并且在某種程度上取決于可用的計算資源。除了晶體本身的結構數據，突變實驗的信息在這里通常也很有價值，因為它可能指出哪些殘基會影響活性位點的反應性或選擇性。通常，優良做法是至少在底物周圍包括殘基的側鏈；但是，有時距離較遠的基團有時會參與反應。
殘基的截斷通常在C-C單鍵處進行，截斷的鍵被氫飽和。為了使模型的整體結構和晶體結構相符，必須固定模型邊界上的許多原子。這些原子通常是進行截短的碳原子，有時是該碳原子上的一個或兩個氫原子，具體取決于模型所需的靈活性。對于金屬酶而言，金屬離子通常將活性位點基團保持在一起，因此在這些情況下需要較少的固定。?酶的省略部分由均質的可極化介質表示，通常假設介電常數為ε=4。系統研究表明，隨著模型尺寸的增長，介電層周圍的影響會迅速減小，并且ε的特定選擇變得不太重要。存在于活動地點的結晶水必須包含在模型中，因為它們是活性位點的架構的組成部分。關于5-羧基香草酸脫羧酶的反應機理的研究很好地說明了驗證這點，該模型中包括多達10個水分子。沒有這些水，量化計算的模型將崩潰并給出錯誤的結果。在某些情況下，即使在晶體結構中看不見水，也必須將水添加到模型中，以填充活動位點中的空隙。此外，特別需要注意的，在簇模型中同樣需要考慮某些殘基（最常見的是Glu，Asp和His）的質子化狀態。這些殘基可能處于質子化或去質子化狀態，從而影響反應的能量。當質子化狀態從結構中不清楚時，可以明確考慮這兩種情況，并可以評估其對反應能譜的影響。雙核鋅酶雙氫乳清酶就是很好的例子，考慮了Asp殘基的兩種質子化狀態，分布計算建模，研究不同的反應機理。下面就舉些應用簇模型研究的機理的例子
檸檬烯環氧化物水解酶（LEH）
檸檬烯環氧化物水解酶（LEH）催化檸檬烯1,2-環氧化物水解為相應的二醇，該反應遵循協同機制，即由Asp活化殘基周圍的水分子，繼而對環氧化物進行親核進攻，并且，質子從另一個Asp轉移至環氧乙烷氧，導致開環并產生最終產物（方案1）。因為環氧乙烷環可在兩個碳原子中的任何一個上打開，所以該反應可導致形成兩個手性二醇產物。但是，大多數非天然底物的對映選擇性非常差。例如，對于環戊烯氧化物，野生型對于生成（R,R）-二醇，僅僅有14％ee值。使用定向進化技術，LEH已被設計為在多種底物上對（S，S）或（R，R）產物產生相當高的對映選擇性。
方案1. LEH催化非天然底物環戊烯氧化物的水解機理
圖片來源 ACS Catalysis
為了研究環戊烯氧化物的開環選擇性，研究人員設計了一個由約250個原子組成的活性位點模型，并確定了進攻底物的C1或C2位置的過渡態。（圖1）。在WT野生型體系中，C1和C2處開環的計算勢壘僅相差0.1 kcal/mol，這與實驗觀察到的非常低的ee值相符?？梢酝ㄟ^以下事實來解釋幾乎相同的反應能壘：環戊烯氧化物比天然底物小得多，因此可以調節其在活性位點內的位置，以同樣好地適應兩種碳原子的進攻。
圖1. 進攻（a）C1和（b）C2原子的過渡態結構，分別導致形成（S，S）-和（R，R）-二醇
圖片來源 ACS Catalysis
非常重要的是，對于包含最多五個點突變的突變體，其計算結果也與實驗一致。
實驗中所有（R,R）選擇性的變體，計算結果都表明在C2處形成開口，所需克服的活化能能壘較低，而對于具有（S,S）選擇性的變體，在C1處形成開口的能壘較低。
可溶性環氧化物水解酶
馬鈴薯（Solaum tuberosum）的可溶性環氧化物水解酶（StEH1）是一種有趣的酶，因為它對底物的兩個對映異構體顯示出不同的偏好性。對于苯乙烯氧化物（SO）衍生物，底物的（S）-對映異構體主要在C1碳原子被進攻，而（R）-對映異構體優選選擇進攻C2位的碳原子上。具體機制如方案 2a 所示
方案2. StEH1對苯乙烯氧化對映體水解和對應的反應機理
圖片來源 ACS Catalysis
與之前的例子LEH相比，StEH1屬于另一類環氧水解酶，反應機理完全不同，涉及烷基化和水解半反應（方案 2b）。在烷基化步驟中，一個環氧乙烷的碳發生親核攻擊，形成酶-底物的中間體IM。隨后的水解反應包括水分子的親核攻擊和隨后形成的四面體中間體IM的塌縮，從而導致最終的二醇產物的形成。?研究人員通過建立280個原子的模型來探究StEH1對映體形成原因。觀察活性位點的結構發現，SO底物可以兩種不同方向結合，即芳香環指向酶內部（稱為“內”方向）或指向外部（稱為“外”方向）。計算得出底物的兩個對映體的兩種結合模式之間的能量差異非常小，因此，對于機理研究，必須將它們全部視為起始酶-底物結構。此外，對于每種結合模式，對環氧乙烷環的親核攻擊都可能發生在環氧乙烷環的C1或C2碳原子上，導致必須計算總共8條反應途徑。因此，對StEH1反應的研究構成了圖3示出了對于（R）-SO底物獲得的四個反應能曲線。?
圖4. StEH1催化的（R）-苯乙烯氧化物水解的計算能量曲線。決定選擇性關鍵過渡態TS的能量以黃色突出顯示
?圖片來源 ACS Catalysis
仔細研究獲得的能量分布，可以發現TS1和TS3的能量非常接近，因此在選擇性分析中必須將它們兩者都考慮在內。對于底物的(R)-對映異構體，計算預測導致(R)-二醇的最低能量途徑是通過在“內”結合模式的C2位置的初始親核攻擊。另一方面，導致(S)-二醇的途徑對應于“出”結合模式中C1位置的初始攻擊。選擇性決定勢壘中的能量差為1.4 kcal/mol，有利于生成R手性的產物，因此計算結果能夠重現StEH1酶的對映收斂行為。就像上面討論的LEH一樣，仔細分析優化的TS結構可以深入了解控制對映選擇性的因素。事實證明，存在底物本身和環氧乙烷環上取代基的性質固有的電子和空間效應。除了這些功能之外，計算還可以查明底物與周圍的活性位點殘基之間的許多特定相互作用，這些相互作用會導致能量歧視。一些π-π和CH-π相互作用被認為對選擇性起著重要作用。?因此，StEH1的情況凸顯了考慮反應機理所有步驟的能量以重現和理解選擇性起源的重要性。
酚酸脫羧酶
酚酸脫羧酶（PADs）催化酚酸向乙烯基酚的非氧化脫羧（方案4 a）。除自然反應外，PAD還被證明可以催化許多具有生物催化作用的混雜反應，例如對羥基苯乙烯的羧化和立體選擇性水合反應（方案 4b）。
方案4.（a）PAD催化的脫羧反應，（b）混雜的水合活性，和（c）根據計算結果提出的水合機理
圖片來源 ACS Catalysis
首先使用簇模型研究反應的機理。計算結果為先前提出的涉及醌甲基化物中間體的機理提供了支持。研究人員使用相同的活性位點模型，探究PAD催化水合反應的反應機理和對映選擇性。?為了獲得高轉化率和對映選擇性，該反應需要碳酸氫鹽作為添加劑。與天然酚酸底物相比，水合反應的底物可以在活性位點周圍采用不同的結合方式。因此，為了鑒定最低能量的結合模式，選取了80多個起始結構，其中底物在活性位點中相對于彼此占據不同的位置。然后進行構象優化評估相應的能量。計算表明，水合反應涉及兩個步驟，如方案 4c 所示：（1）用谷氨酸使底物質子化，生成醌甲基化物中間體；（2）水分子在α-處發生親核攻擊，這兩個步驟都涉及碳酸氫鹽作為質子穿梭的介導。在該機理研究中，遵循了20種能量最低的E：S配合物的整個水合路徑，以確保所定位的中間體和過渡態代表能量最低的結構。?這在對映選擇性的分析中尤其重要，如上所述，在對映選擇性中，準確性必須很高。該計算可以再現觀察到的對映選擇性，其中發現最有利的途徑導致(S)手性產物的形成。計算得出導致R產物的途徑的能量提高了2.3 kcal / mol（圖5），與87％的實驗ee值高度吻合，后者相當于1.6 kcal/mol的反應勢壘。?
圖5.確定對映選擇性的過渡態的優化結構和示意圖，該過渡態在PAD催化的水合反應中導致生成（a）（S）產物和（b）（R）產物
圖片來源 ACS Catalysis
然后，可以通過比較決定選擇性的過渡態的幾何形狀來確定立體感應的起源（圖5）。首先，通過與周圍殘基形成氫鍵，限制了甲基苯醌中間體和碳酸氫鹽的氧側位置，而C═C雙鍵可以指向不同的方向，而Si或Re面都指向親核體水。在TS2-S中，它導致（S）-對映體，甲基指向Val70和Ile85區域，而在TS2-R中，它導致（R）-對映體，甲基指向Tyr31側鏈，在空間上更擁擠。最近的一項突變實驗也提供了支持。即證明用谷氨酸或甲硫氨酸代替Arg41導致產物的ee降低。?該突變可通過削弱Tyr39的氫鍵網絡使Tyr39側鏈更具柔性，從而減少空間位阻。在沒有碳酸氫鹽的情況下，實驗表明水合反應產生醇產物的幾乎外消旋的混合物。隨后采用相同的方法研究氰化物向對羥基苯乙烯中不對稱加成的機理和對映選擇性。關于反應機理和對映選擇性的起源，得出了非常相似的結論。
結論
如今，密度泛函理論是研究均相催化領域的反應機理和對映選擇性的巨大成功工具。在本文中，研究人員討論了許多使用基本相同的方法研究酶中不對稱反應的最新例子。簇模型是一種計算研究酶反應的強大方法。隨著計算機能力的提高，設計建模較大的簇模型成為可能，該模型可以完美地表示活性位點的手性環境，從而可以研究酶的對映選擇性。上述的三個例子表明，簇模型可以很好地模擬酶中的對映選擇性，并提供了對控制反應性和選擇性的因素的寶貴見解。重要的是，基本的DFT方法的精度已被證明足夠高，可以再現描述選擇性所必需的過渡態能量的微小差異。精度和速度之間的良好平衡是DFT方法廣泛使用的關鍵。在未來的幾年中，DFT將繼續成為這種方法的主力軍。在一些討論的酶中，與實驗相比，發現選擇性趨勢被高估或低估了。這種影響可以至少部分地歸因于所采用的簇模型的大小，在某些情況下，這種模型不能賦予活性位點組足夠的靈活性以適應反應期間可能發生的幾何形狀變化。解決此缺點的一種方法是，將截斷原子置于模型的外圍處于軟約束電位中，而不是完全固定它們。在未來幾年中，簇模型將更頻繁地與其他互補方法結合使用，成為一種常見的量化研究酶中的反應機理的計算方法
參考文獻
Modeling Enzymatic Enantioselectivity using Quantum Chemical Methodology. ACS Catal. 2020, 10, 11, 6430–6449.https://doi.org/10.1021/acscatal.0c00983