NAR | ProteinTools:蛋白結構分析竟如此簡單

背景介紹

蛋白質的三維結構對其生物學功能來說至關重要，因此能準確對蛋白結構進行表征或預測意義重大。蛋白是在各種非共價相互作用(如氫鍵、范德華力、疏水和離子相互作用)的驅動下折疊成天然結構的。因此，要在分子水平上理解蛋白質的特征和功能，就必須對這些相互作用進行描述?，F有結構生物學中的大多數計算工作都集中在蛋白質結構預測上，一些用于結構分析的工具只提供了對單個結構屬性的分析，并且研究者通常需要適應不同編程語言編寫的軟件包。本文介紹了拜羅伊特大學團隊開發的一款名為ProteinTools 的web服務。相比于其他的工具包，ProteinTools無需繁瑣的編程，僅需要通過輸入PDB編號或者上傳蛋白結構即可快速獲得四種不同結構屬性分析結果。本文以Di-III_14結構域為例展示了ProteinTools中四種應用程序的應用。

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使用手冊

Di-III_14是含有74個氨基酸長度的蛋白，其結構中含有四條β-折疊片和兩個排列在β折疊片的一邊的α螺旋。β折疊的順序是1243，其中4號鏈與其他的β片呈反向平行。研究人員觀察到，雖然Di-III_14蛋白在毫秒級的時間內以兩種狀態展開，但其在高濃度尿素中卻可以維持折疊幾秒鐘，這在天然蛋白質中是一種不常見的特征。實驗揭示了許多在慢時間尺度內相互轉換的高能狀態，這種狀態與大型靜電網絡和疏水簇的形成具有結構相關性。本文作者使用ProteinTools來顯示這些屬性的計算。

Di-III_14蛋白包含一個大的疏水簇

對Di-III_14進行的氫交換(HDX) NMR分析結果顯示了在慢時間尺度上構象狀態之間的變換過程，這與氯化胍變性中顯示的快速展開過程存在顯著差異。雖然這兩種過程都傾向于提供天然蛋白質中可比較的評估，但在蛋白質設計過程中進行的穩定性優化可以引入多種相互作用以穩定緊密排列的內部，導致在天然蛋白質中觀察不到的復雜行為。作者將強保護的主鏈酰胺氫(NHs)映射到結構上，發現它們對應于一個被極性側鏈包圍的大型疏水核。疏水簇的分析顯示，單個簇包含14個殘基，總面積為1654.0?²。該簇跨越所有二級結構元素的殘基，大多數氨基酸屬于β鏈。每個殘基的面積是44.7 ?²，殘基之間有37個相互作用。為了解這些參數是否與一種緊湊的IF3-樣蛋白相對應，作者比較了Di-III_14的疏水簇與天然IF3樣蛋白的疏水簇。隨后，作者從SCOPe(40)下載了所有結構域。SCOPe是一個根據蛋白質的拓撲結構和進化關系進行分類蛋白結構的數據庫。IF3樣蛋白SCOPe標識符為d.68。提取d.68折疊的全部蛋白后，作者剔除了序列長度超過150個氨基酸的蛋白，得到43個結構。使用ProteinTools對這些結構進行可視化顯示，每個結構的平均的疏水簇的數量為2.2，位于螺旋和折疊鏈之間的疏水簇的面積在所有情況中是最大的。這些蛋白的疏水簇的平均面積是1957.5 ?²，略大于Di-III_14 (1654.0 ?²)，但在標準偏差(±1078.9 ?²)之內。平均殘基量為14.1，與Di-III_14的分析結果一致。用于比較，圖lb展示了一個具有代表性的IF3-like蛋白，其含有三個疏水簇，最大的疏水簇面積為1978 ?²。根據這些結果，不能得出Di-III_14的疏水簇與IF3-like天然蛋白的疏水簇有顯著差異的結論。

圖1. Di-III_14和某IF3-樣蛋白的疏水簇分析。圖片來源于：NAR

氫鍵網絡

Basak等人觀察到兩個靜電網絡，一個跨越αl和α2的表面，另一個包含四個鹽橋連接兩個內部β鏈，β2和β4。為了總結這些發現，作者計算了Di-III_14的氫鍵網絡(https://proteintools.unibavreuth.de/bonds/structure/21n3)，ProteinTools通過觀察2.5 ?距離和120°角內的氮和氧供體及受體，來計算側鏈之間的氫鍵網絡。Di-III_14包含8個氫鍵網絡(圖2)。最大的一個與Basak等的描述類似，貫穿β1、β2和β4，包含6個殘基(氫鍵網絡4，圖2，淺綠色)。這些殘基分別是Thr6, Glu30, Glu32。Gln64, Arg69和Arg71。另外兩個網絡加強了內部鏈的相互作用:網絡5(藍色，Asp34和Lys67)和網絡7(暗黃色，Asp28和Ser 75)。

在作者的分析中，觀察到螺旋中總共有四個氫鍵網絡，其中三個主要跨越α2。網絡3(橙色)由殘基Glu 45、Glu49和Lys61組成，將α2和β3連接在一起。類似地，網絡0(紅色)通過β1中的Ser9與α1中的Asn11和Glu4將β鏈和螺旋連接起來。另外兩個網絡對應于網絡2(黃色)，完全包含在α2 (殘基Asp50和Lys 54)和網絡1中(深綠色)，通過Lys12和Glu43連接αl和α2。?

圖2. Di-III_14的氫鍵網絡分析。圖片來源于：NAR

鹽橋

ProteinTool的鹽橋應用能夠在蛋白質中找到鹽橋網絡并計算電荷分離參數。作者在https://proteintools.uni-bayreuth.de/salt structure/21n3上計算了Di-11I_14的鹽橋(圖3)。發現Di-III_14有6個鹽橋網絡。最大的一個是鹽橋4(突出顯示)，由氫鍵網絡4中的許多殘基組成:Glu30、Glu32、Arg69和Arg71；此外還有鹽橋3 (Lys67和Asp34)，跨越內部的β片。鹽橋2連接β4和α2 (Lys61, Glu45和Glu49)，而鹽橋0則連接αl和α2 (Lys12, Glu13，Glu40和Glu43)。最后，鹽橋1通過其殘基為Asp50、Lys53和Lys54跨越α2的一半。研究結果與Basak等人的結果基本保持一致，但由于作者更嚴格地將殘基對之間的距離限制在4?以內，使得結果與Basak等人的有一些差異。

Basak等人認為，不同尋常的大量帶電側鏈的組成將Di-III_14的折疊機制與天然蛋白質區分開。他們繪制了嗜熱Sulfolobus solfataricus幾乎整個蛋白質組的帶電殘基(FCR)與κ的比值，并觀察到Di-III_14出現在不同的區域。ProteinTools也能夠計算這些參數，FCR為0.35、k為0.25,結果與Basak等人的一致。

圖3. Di-III_14的鹽橋網絡。圖片來源于：NAR

接觸圖

蛋白質接觸圖展示了所有可能的氨基酸對之間的距離，并提供旋轉和翻譯固定的蛋白質結構的簡寫。它們在機器學習方法中得到了廣泛的應用，并可以用于重建三維結構或進行蛋白質相似性分析。因此，接觸圖的快速計算對于各種用途都是有用的。本文作者以Di-III_14為例，計算了其接觸圖(圖4)。?

圖4. Di-III 14的接觸圖。圖片來源于：NAR

討論

Web應用程序在過去幾年變得特別有用:它們無需安裝和學習特定的程序。ProteinTools作為一個模塊化工具包來分析蛋白質結構。到目前為止，共實現了四種非常重要的分析工具:疏水簇、氫鍵網絡、鹽橋和接觸圖。這是全球第一款用于計算疏水簇和氫鍵網絡的web服務器。該工具包的模塊化特性將使添加其他應用程序到ProteinTools變得容易。作者設想在不久的將來集成一個應用程序，用于突變體的生成和評估其△△G°，以及空腔的計算。

參考文獻

Ferruz N, Schmidt S, Hocker B. ProteinTools: a toolkit to analyze protein structures. Nucleic Acids Res 2021;49:W559-W566.