引言
天然產物抗生素作為治療藥物的特性通常很差，并且受制于共同進化產生的耐藥機制。改進供人類使用的天然抗生素的主要方法是半合成，即通過對生物生產獲得的天然產品進行化學修飾。這種方法改善了許多天然產物的藥理特性，但在克服耐藥機制方面僅取得了有限的成功。最近，化學方面的進步使人們能夠通過完全合成的途徑獲得抗生素，從而提供新的方法來克服耐藥性。
鏈球菌素抗生素由兩個結構不同的組分(A和B)組成，它們通過協同作用，抑制細菌核糖體，在許多生物體中實現殺菌活性。A組抗生素與肽基轉移酶中心(PTC)結合，并增加與鄰近新生肽出口通道的B組分的親和力。與其他以PTC為靶點的抗生素類似，對A組鏈陽菌素的耐藥可通過F (ABC-F)家族蛋白的AYP-結合盒來去除抗生素，或通過Cfr甲基化23S rRNA的A2503來阻止結合。A組鏈球菌的特異性耐藥機制是弗吉尼亞霉素乙酰轉移酶(Vats)失活。這些蛋白質乙?；疌14醇，導致空間干擾和關鍵氫鍵的破壞。
在這里，加州大學舊金山分校 Ian B. Seiple團隊報道了具有廣泛結構變異的A組鏈球菌素抗生素的設計、合成和抗菌評價。利用冷凍電子顯微鏡和量子化學計算，研究者描述了8個類似物與細菌核糖體在高分辨率下的結合，揭示了延伸到肽酶tRNA結合位點的結合相互作用，以及與占領初期肽出口通道的協同結合物的結合。其中一種類似物對幾種耐鏈球菌的金黃色葡萄球菌具有極好的活性，在體外乙?；式档?，并能有效降低小鼠感染模型中的細菌負荷。
基于結構的合理設計
在此，研究者假設A組鏈陽菌素可以被設計成避免Vat乙?；?，同時維持或改善核糖體結合。同時，選擇天然產物維吉霉素M2 (VM2)作為起始骨架，因為它能夠通過C16氟化作用轉化為更活躍的類似物(例如flopristin, 4)。為了指導模擬物設計(在克服Vat結合的同時保持核糖體活性)，研究者獲得了2.5-?分辨率的冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)結構，完全合成的VM2與大腸桿菌50S核糖體結合。核糖體作為低溫電子顯微鏡樣品的優勢特性使密度的特性得以保證，而通過力場引導的改進使模型得以保證，這兩方面都促進了模擬物的設計。研究發現，結合決定因素與其他相關的A組鏈球菌結合細菌和原始核糖體的共結晶數據一致。
在核糖體中，VM2上的C3異丙基參與與U2585表面的疏水相互作用，但在其他方面缺乏結合相互作用，并向tRNA P-位點投射，這表明C3修飾是可耐受的。同樣，C4甲基和C6質子也沒有發生結合作用，且在出口通道中呈向B組鏈陽菌素結合位點傾斜。相比之下，抗性酶VatA的誘變和結晶學鑒定了這些基團(C3異丙基、C4甲基和C6質子)和乙?；匦璧慕Y合位點殘基之間的關鍵相互作用。這些位點的結構修飾可能會破壞VatA結合并克服Vat抗性，但目前只報道了在其中一個位點修飾的半合成鏈陽菌素(C5-C6烯烴氫化)。這些部位的廣泛半合成修飾限制了缺乏官能團的化學選擇性激活。
結構類似物的模塊化合成
為了直接驗證C3和C4結構修飾可以克服基于vat的抗生素耐藥性的假設，研究者首先開發了具有前所未有的結構多樣性的A組鏈陽菌類抗生素合成管道。研究者的A組鏈菌素路線(例如圖1a中的VM2)包括7個簡單的、可單獨分散的化學構建塊的聚合組合。圖1a所示的路線具有技術改進的特點，通過左右、半序列提高了產量，分別為(31%到40%)和(18%到28%)。
圖1 模塊化合成獲得了60多種全合成的A組鏈陽菌素類抗生素
通過構建塊變異，研究者制備出了18種鏈球菌蛋白，包括天然產物VM2、弗吉尼亞霉素M1 (VM1)、馬杜霉素I(33)和馬杜霉素II(34)(圖1b)。
用對甲氧基芐基保護的(R)或(S)-3-羥基-2-甲基丙醛替換左半序列中的異丁醛，可獲得C3 -異丙基修飾的類似物38和39(圖1c)。這些鏈鎖蛋白中的每一種都可以與17種市售芳基異氰酸酯發生反應，產生34種新的鏈鎖蛋白類似物，它們在C3位置具有芳基氨基甲酸側鏈(40a-q和41a-q)。此外，通過四步序列在C16位點安裝氟，提供臨床候選flopristin(4)和幾種氟類似物(圖1e)。
體內和體外的療效
研究者評估了62個新的A組鏈球菌抗生素類似物、4個天然產物和第一個全合成的flopristin樣品(4)對20個病原體的活性(圖2a)，其中包括3個已知鏈球菌耐藥機制的菌株。與VM2相比，類似物26、40q和21對野生型和VatA金黃色葡萄球菌表現出相同或提高的活性，而它們的C16氟化同源物(45、46和47)表現出顯著提高的活性。值得注意的是，類似物46和47對野生型和VatA金黃色葡萄球菌的抗性比flopristin(4)強16到32倍。此外，47對ABC-F表達的糞腸桿菌和革蘭氏陰性大腸桿菌具有可測量的活性，這兩種大腸桿菌對鏈球菌具有高度耐藥性。
圖2 所選A組鏈球菌素的抗菌活性和體內療效
研究者對47含有vat基因的金黃色葡萄球菌臨床分離株進行了測試。Vat基因通常伴有vga基因，vga基因編碼ABC類蛋白，也對A組鏈陽菌素產生抗性(圖2b)。與預期的一樣，VM2并沒有有效抑制這些鏈球菌耐藥菌株的生長。Flopristin(4)表現出良好到中度的活性，而47表現出優異到中度的活性。這些數據表明，完全合成的C4修飾的鏈霉陽菌素47能有效抑制具有A組鏈球菌耐藥基因的臨床多藥耐藥分離株的生長，通常比臨床候選的flopristin(4)更有效。
考慮到47對鏈球菌耐藥菌株的體外活性，研究者接下來在小鼠大腿模型中測試了其有效性，使用金黃色葡萄球菌CIP 111304(菌株2)，該菌株表現出高水平的A組鏈球菌耐藥性(圖2c)。
作用和耐藥的機制
與低MIC值一致的是，4和47在體外對翻譯的抑制作用比VM2更有效(圖3a)。IC50值類似于4和47，這表明它們的MIC差異是由其他因素造成的，而不是由增強的核糖體抑制所致。為了確定47對低速率VatA乙?；慕Y構貢獻，研究者獲得了一個X射線共晶結構(圖3b)，顯示在VatA (PDB代碼4HUS2)中，由于47的C4延伸空間碰撞，Leu110與VM1相比位移了1.5 ?。
基于flopristin(4)結合到核糖體的晶體結構，化合物46使用Maestro的LigPrep工具構建(v2019-4, Schr?dinger Inc.)。通過與flopristin的共晶體結構的低能量位相比較，驗證了大環構象采樣方法(4)。采用全采樣強度策略，得到了46的1000個構象，其中RMSD <2 ?的最低質能位(4個骨架原子作為參考原子)被認為是首選構象。最后，通過對骨架原子施加約束，以B3LYP/6-31G*為基礎，使用Jaguar軟件對這種優選構像的C3側鏈進行進一步優化。
圖3 體外乙?；?，VatA結合，和高活性類似物的核糖體結合
細菌的PTC是一個特殊的抗生素結合位點(圖3e)。值得注意的是，46的芳基氨基甲酸酯側鏈和47的烯丙基側鏈與其他配體沒有明顯重疊，而且它們不排除與VS1結合。46中芳基氨基甲酸酯側鏈的位置延伸到P位點(圖3f)。通過將P-位點結合tRNA的五端堿基覆蓋到46和與催化中心結合的VS1結構中，發現46中的異喹啉基團與所有tRNA中保守的末端腺苷基本重疊。A組鏈陽菌素的23元大環核可能為原核核糖體的選擇性提供了基礎，這是tRNA擬合物，如blasticidin無法實現的。
展望與結論
結合理性藥物設計、模塊化化學合成、抗菌評價、體外分析和高分辨率冷凍電鏡技術，研究者開發了一條A組鏈球菌素類抗生素的合成和優化途徑。該方法可以通過構造塊變化和后期多樣化的方式制備新的類似物，提供有價值的構效關系。在骨架上兩個先前未探索的位置進行修飾，使第一組A鏈蛋白克服了Vat酶引起的抗性。盡管其他耐藥機制的出現是不可避免的，但這種方法可能允許化學適應延長鏈鎖菌素類的臨床壽命。
參考文獻
Li, Q., Pellegrino, J., Lee, D.J. et al. Synthetic group A streptogramin antibiotics that overcome Vat resistance. Nature 586, 145–150 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2761-3